Арт. STEDYCON 2
Пространственное разрешение, которое достигается современными световыми микроскопами, позволило заглянуть в мир живых систем на уровне отдельных молекул. Размер больше не является препятствием для изучения биологии на самом фундаментальном уровне. Однако жизнь не статична — она проявляется через движение и изменения. Насколько технологии сверхразрешающей микроскопии справляются с задачей документирования динамических биологических механизмов?
Почему сверхразрешение важно для биологии
Биологические исследования проникли в область мельчайших масштабов. Сегодня мы изучаем отдельные клетки, а не усредняем их поведение в тканях. Мы идентифицируем ранее неизвестные микроорганизмы исключительно по новым последовательностям ДНК. Мы даже исследуем квантовые основы фотосинтеза и магнитный компас перелётных птиц. Разрешение, с которым мы наблюдаем жизнь, совершило гигантский скачок — во многом благодаря развитию микроскопии. Но в каких случаях сверхразрешение оказывает наибольшее влияние на наше понимание живых систем?
Биология как наука о мельчайшем
Самые захватывающие биологические процессы происходят в масштабах, недоступных невооружённому глазу. А с учётом того, что молекулярная биология лежит в основе биотехнологического и биомедицинского бума XXI века, утверждение о том, что сверхразрешение имеет решающее значение для биологии, вовсе не является преувеличением. Фактически взаимодействия и процессы, лежащие в основе жизни, происходят в масштабах ниже дифракционного предела.
Рис. 1. Масштабы жизни. Глубокое понимание биологических процессов достигается ниже дифракционного предела.
Существует целый ряд технологий световой микроскопии, которые достигают или превосходят дифракционный предел света (~200 нм), включая микроскопию STED и MINFLUX. Эти методы значительно различаются по сложности экспериментальной установки, подготовке образцов, обработке данных после получения изображений и возможностям работы с живыми объектами. Тем не менее все они открывают доступ к наномасштабному миру, всё ближе подходя к разрешению электронной микроскопии. Таким образом, сегодня биолог, которому необходимо визуализировать клеточную структуру или молекулу на уровне нескольких нанометров, может выбрать из множества альтернатив узкоспециализированным методам, требующим высокой квалификации, сложного оборудования, больших затрат времени и разрушения образца. Как мы увидим далее, такие альтернативы критически важны для исследования биологии по целому ряду причин.
Когда важен размер
На протяжении десятилетий электронная микроскопия доминировала в получении впечатляющих изображений субклеточных структур и молекул. Однако сегодня технологии сверхразрешающей микроскопии делают подобную детализацию стандартом и для световой микроскопии. Возьмём, к примеру, митохондрии. Складки их внутренней мембраны — кристы — являются местом синтеза АТФ. Митохондрии и их кристы отличаются высокой динамичностью, изменяя форму и количество. Визуализация крист позволяет установить связь этих изменений с метаболическим состоянием клетки, однако для этого требуется разрешение значительно ниже среднего расстояния между кристами (~100 нм).
С использованием недавно разработанных флуоресцентных красителей исследователи применили STED-микроскопию для визуализации характерной полосчатой структуры митохондрий с разрешением до 35 нм. Метод MINFLUX позволяет достичь разрешения вплоть до 2 нм, что делает возможным различение отдельных молекул.
Когда важно время
Измерения размеров и расстояний играют ключевую роль в характеристике субклеточных сред, однако сами по себе они не позволяют раскрыть жизнь во всём её многообразии. Жизнь — это движение и взаимодействия, а временные масштабы этих процессов варьируют от наносекунд (конформационные изменения белков) до минут (репликация ДНК). Очевидно, что временное разрешение визуализации является критически важным для получения значимых биологических наблюдений на молекулярном уровне. Электронная микроскопия здесь достигает своих пределов, поскольку требует фиксации образцов и не предоставляет информации о временных корреляциях.
Рис. 2. Временное разрешение имеет решающее значение для понимания молекулярных движений и взаимодействий, конформационных изменений белков и ферментативного катализа.
Некоторые методы сверхразрешающей микроскопии обеспечивают временное разрешение, достаточное для наблюдения жизненных процессов (рис. 2). Например, STED позволяет вести быструю съёмку (порядка 1 кадра в секунду). Используя фотостабильные красители, устойчивые к длительной визуализации, Янг и соавторы задокументировали изменения формы отдельных митохондрий в течение 10 и 60 минут. Полученные видеозаписи показывают образование пузырьков в митохондриях в процессе деления. Эти пузырьки быстро заполняются кристами, после чего отделяются, формируя отдельные небольшие митохондрии [Yang, X. et al. 2022].
В других исследованиях сверхразрешающие методы применялись для отслеживания движения белков, таких как перемещение AMPA-рецепторов в нейронах, транслокация мембранно-связанных молекул гликозилфосфатидилинозитола (GPI), а также диффузия белка Hfq при его связывании с мРНК в E. coli. Наконец, MINFLUX выводит эти возможности на новый уровень: благодаря высокой фотонной эффективности он обеспечивает временное разрешение порядка 100 мкс при сохранении высочайшей пространственной детализации. Это позволяет отслеживать диффузию отдельных липидов в биологических мембранах или конформационные изменения кинезина-1 при его движении вдоль микротрубочек [Schmidt et al. 2021; Wolff, J. O. et al. 2023; Deguchi, T. et al. 2023].
Рис. 3. Приблизительные диапазоны пространственного и временного разрешения различных методов микроскопии.
Когда важен контекст
Длительная визуализация биологических процессов с высоким разрешением — это не только вопрос скорости съёмки. Не менее важно сохранить образец живым, ведь именно в этом и заключается контекст биологических исследований. Основная сложность состоит в предотвращении повреждения образца в результате подготовки или токсического воздействия высокоэнергетического и длительного возбуждения.
В литературе можно найти ряд оригинальных решений этой проблемы. Например, событийно-инициируемая STED-микроскопия снижает фотообесцвечивание и токсичность, связывая автоматизированную STED-съёмку с обнаружением клеточного события, такого как рекрутирование белков или транспорт везикул.[Alvelid, J. et al. 2022]. В особенно впечатляющем примере визуализации in vivo STED-микроскопия была использована для регистрации динамических изменений дендритных шипиков соматосенсорных корковых нейронов у мыши. Во время эксперимента животное оставалось живым, а тонкие детали нейронных структур были выявлены с пространственным разрешением менее 70 нм [Willig, K. et al. 2022.].
Сверхразрешение в биологии — это не только размер
В перспективе наше понимание биологических процессов и возможность использовать их в прикладных целях будет всё в большей степени зависеть от методов, предлагающих не только исключительное пространственное разрешение. Они должны также соответствовать временным масштабам биологических событий и позволять регистрировать молекулярные взаимодействия in vivo. Развитие сверхразрешающей микроскопии находится на пороге объединения этих трёх измерений — размера, времени и контекста — в рамках одной удобной технологии. Наш взгляд на жизнь становится яснее, чем когда-либо прежде.
