Плейотропная роль генов Dlx5/6 в развитии слухового аппарата и голосового тракта
Акустическая коммуникация является важнейшим механизмом взаимодействия позвоночных животных. Для её реализации необходимо согласованное функционирование двух тесно связанных систем: органов генерации звука и органов его восприятия. К первой относятся структуры голосового тракта — челюсти, язык, глотка и гортань, ко второй — наружное, среднее и внутреннее ухо. Несмотря на очевидную функциональную взаимосвязь этих систем, механизмы их совместного развития остаются недостаточно изученными. Особый интерес представляет поиск генетических факторов, способных одновременно контролировать формирование как слухового аппарата, так и органов голосообразования.
В работе [1] исследовалась роль транскрипционных факторов Dlx5 и Dlx6 в развитии структур, обеспечивающих восприятие и воспроизведение звуков. Для этого была использована модель условной инактивации Dlx5/6 в Sox10-позитивных клетках эмбрионов мыши. Поскольку линия Sox10 маркирует как клетки нервного гребня, формирующие значительную часть структур головы и шеи, так и клетки ушной плакоды, данная модель позволила одновременно исследовать развитие слухового аппарата и голосового тракта.
Рисунок 1. Фенотип Dlx5/6-мутантных эмбрионов и трёхмерные реконструкции слухового аппарата и голосового тракта
Для изучения морфологических изменений авторы использовали комплекс современных методов визуализации, включающий иммуногистохимическое окрашивание, гибридизацию in situ, микрокомпьютерную томографию и светолистовую флуоресцентную микроскопию (Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM). Особое значение в работе имело применение светолистовой системы Alpha3 (PhaseView, Франция).
Система Alpha3 относится к классу микроскопов LSFM, в которых объект освещается не целиком, а исключительно тонким световым листом толщиной несколько микрометров. Световой лист формируется перпендикулярно оптической оси объектива регистрации и последовательно перемещается через весь образец. Благодаря этому возбуждение флуоресценции происходит только в исследуемом слое, тогда как остальные области образца не подвергаются воздействию лазерного излучения. Такой подход существенно уменьшает фототоксичность и фотоблекание по сравнению с конфокальной микроскопией и позволяет получать большие объёмы данных за значительно меньшее время.
В работе использовалась установка Alpha3, оснащённая многоиммерсионным объективом Olympus XLPLN 10× с числовой апертурой 0,6 и адаптацией к показателю преломления среды в диапазоне 1,33–1,52. Для возбуждения флуоресценции применялись лазеры с длинами волн 405, 488, 561 и 635 нм, что позволяло одновременно регистрировать несколько флуоресцентных меток. Перед визуализацией эмбрионы подвергались процедуре оптического просветления, благодаря чему становились практически прозрачными и могли исследоваться целиком без необходимости механического разделения на серийные срезы.
По сравнению с традиционной гистологией такой подход обладает рядом преимуществ. При классическом анализе исследователь получает информацию только из отдельных двумерных срезов, а пространственные взаимоотношения между структурами приходится восстанавливать косвенно. Кроме того, при изготовлении серийных срезов возможны деформации тканей, потеря отдельных участков материала и накопление ошибок при реконструкции. Светолистовая микроскопия позволяет исследовать интактный эмбрион целиком, сохраняя естественную трёхмерную организацию тканей и обеспечивая возможность последующей цифровой реконструкции органов.
Основные морфологические изменения были выявлены именно благодаря трёхмерному анализу. У мутантных эмбрионов обнаружены выраженные дефекты развития нижней челюсти, отсутствие или резкое уменьшение хряща Меккеля, нарушения формирования языка, деформации наружного и среднего уха, а также серьёзные изменения внутреннего уха. Трёхмерные реконструкции позволили проследить пространственное расположение слуховых косточек, полукружных каналов и улитки и продемонстрировать степень их деформации значительно нагляднее, чем это возможно при анализе отдельных гистологических срезов.
Следующим этапом работы стало исследование формирования периферической нервной системы. Для этого авторы выполнили иммуномечение нейрофиламентов и мышечных предшественников с последующей съёмкой целых эмбрионов методом LSFM. Трёхмерная визуализация позволила проследить ход нервов на протяжении всего эмбриона и оценить их связь с формирующимися мышцами и органами.
Было показано, что инактивация Dlx5/6 вызывает серьёзные нарушения иннервации. Нижнечелюстная ветвь тройничного нерва приобретала признаки верхнечелюстной ветви и демонстрировала аномальное ветвление. Наблюдались дефекты проекций преддверно-улиткового нерва к развивающемуся внутреннему уху. Кроме того, отсутствовала нормальная проекция барабанной струны лицевого нерва к зачатку языка. Такие изменения свидетельствуют о том, что Dlx5/6 участвуют не только в формировании анатомических структур, но и в организации нейронных связей между ними.
Рисунок 2. Полное иммунофлуоресцентное окрашивание контрольных и мутантных эмбрионов
Для выяснения молекулярных механизмов наблюдаемых нарушений авторы проанализировали экспрессию генов Bmper, Msx1 и Hand2 — компонентов BMP-сигнального пути. Было установлено, что во всех исследованных областях экспрессия данных генов существенно снижалась или полностью исчезала после инактивации Dlx5/6. Наиболее выраженные изменения наблюдались как в жаберных дугах, так и в развивающемся ушном пузырьке.
Полученные данные позволили авторам предложить единую модель развития слухового аппарата и голосового тракта. Согласно этой модели, Dlx5/6 регулируют активность BMP-сигналинга в производных линии Sox10 и обеспечивают координированное развитие органов восприятия и генерации звука. Таким образом, один генетический механизм одновременно контролирует формирование структур, отвечающих как за слух, так и за вокализацию.
Рисунок 3. Фенотип мутантов Dlx5/6 на поздней стадии эмбрионального развития.
Работа продемонстрировала, что гены Dlx5/6 являются ключевыми регуляторами общего генетического механизма, координирующего развитие органов восприятия и воспроизведения звуков у млекопитающих.
Микроскоп Alpha3 от PhaseView успешно применяется для получения высококачественных трёхмерных изображений целых органов и эмбрионов, что делает его эффективным инструментом для современных биомедицинских исследований.
Для получения дополнительной информации, участия в демонстрации оборудования или консультаций по подбору конфигурации микроскопа Alpha3 от PhaseView обращайтесь к менеджерам компании АЗИМУТ ФОТОНИКС.
[1] Sánchez-Garrido F, Bouzerand V, Kaiser M, Chaumeton C, Fontaine A, Zikmund T, et al. (2025) Pleiotropic function of Dlx5/6 in the development of mammalian vocal and auditory organs. PLoS One 20(12): e0337426.
