Метаболическая визуализация NAD(P)H и FAD FLIM
NAD(P)H (никотинамид-аденин-(пиридин)-динуклеотид) и FAD (флавин-аденин-динуклеотид) являются коферментами, участвующими в метаболизме клеток. И NAD(P)H, и FAD являются флуоресцирующими. FAD и, особенно, NAD(P)H являются уникальными в том смысле, что их интенсивности флуоресценции и функции затухания флуоресценции несут прямую информацию о метаболическом состоянии клеток: время жизни флуоресценции NAD(P)H и FAD зависит от связывания с белками. Несвязанный NAD(P)H имеет время жизни флуоресценции от 0.3 до 0.4 нс. Время жизни связанного NAD(P)H составляет около 1.2 нс. Для FAD эффект связывания противоположен: время жизни связанного FAD составляет несколько 100 пс, а несвязанного FAD - несколько нс.
Рис. 1. Состав функций распада NAD(P)H и FAD
Важно, что соотношения количества связанного и несвязанного NAD(P)H, а также связанного и несвязанного FAD зависят от типа метаболизма. Переход от гликолиза к окислительному фосфорилированию или обратно приводит к изменению отношения несвязанных/связанных: гликолиз дает высокий a1/a2 для NAD(P)H и низкий a1/a2 для FAD, окислительное фосфорилирование дает низкий a1/a2 для NAD(P)H и высокий a1/a2 для FAD. Связанные/несвязанные соотношения прямо отражают «эффект Варбурга»: в нормальных клетках преобладает окислительное фосфорилирование, в раковых клетках - восстановительный гликолиз. Нормальные клетки и раковые клетки могут поэтому отличаться их отношениями a1/a2 или только a1 (потому что a1 + a2 = 1). Следует отметить, что изменения в a1 или a1/a2 неявно присутствуют также в взвешенном по амплитуде времени жизни tm и взвешенном по интенсивности времени жизни ti. Однако время жизни самих компонентов распада зависит от других параметров молекулярной среды, таких как митохондриальный уровень кислотности рН. Поэтому время жизни нельзя использовать в качестве параметра абсолютной дискриминации.
Длины волн возбуждения и испускания
Приблизительные спектры возбуждения и испускания NAD(P)H и FAD показаны на рисунке ниже. На рисунке показано, что сигналы флуоресценции от NAD(P)H и FAD могут быть разделены, только если используются разные длины волн возбуждения и разные длины волн детектирования.
Рис. 2. Спектры возбуждения и излучения NAD(P)H и FAD
Подходящие длины волн однофотонного возбуждения составляют от 350 до 375 нм для NAD(P)H и от 405 до 420 нм для FAD. Две длины волн фотонного возбуждения составляют 750 нм и 920 нм соответственно. Интервалы длин волн обнаружения составляют от 425 до 475 нм для NAD(P)H и от 475 до 600 нм для FAD.
Одновременное измерение NAD(P)H и FAD
Чтобы минимизировать влияние фотообесцвечивания, дрейфа фокуса, возможных физиологических изменений, желательно регистрировать FLIM данные NAD(P)H и FAD одновременно. Это может быть получено с помощью лазерного мультиплексирования и мультиплексирования TCSPC: лазеры мультиплексируются синхронно со сканером либо построчно, либо кадр за кадром. Сигналы в двух интервалах длины волны излучения регистрируются двумя параллельными каналами FLIM. Все необходимые функции реализованы в конфокальной сканирующей системе FLIM DCS-120 от Becker&Hickl. Таким образом, метаболический FLIM со сканирующей системой DCS-120 - это только вопрос использования правильных лазеров и выбора правильных параметров настройки. С системами FLIM от Becker&Hickl, подключенными к другим лазерным сканирующим микроскопам, метаболический FLIM может, в принципе, выполняться, если используются правильные лазеры и они подготовлены к мультиплексированию.
Типовые результаты
Изображения, показанные ниже, были получены с помощью сканирующей системы DCS-120 с лазерами BDL-SMN с длиной волны излучения 375 нм и 405 нм. Лазеры были мультиплексированы кадр за кадром, и изображения записывались в двух каналах системы DCS-120.
Рис. 3. NAD(P)H a1 изображения для нормальных клеток (слева) и опухолевых клеток (справа). Нижний ряд: гистограммы a1 по пикселям изображений.
Рис. 4. Изображения FAD a1 для нормальных клеток (слева) и опухолевых клеток (справа). Нижний ряд: гистограммы a1 по пикселям изображений.
Приведенные выше данные демонстрируют, что распределение амплитуды компоненты быстрого распада a1 в NAD(P)H и на изображениях FAD различно для нормальных клеток и опухолевых клеток.