Многофотонная томография кожи человека использует тот факт, что двухфотонное возбуждение в сочетании с внешним детектированием (геометрия non-descanned) позволяет получать оптические срезы слоев ткани глубиной до 100 мкм. Трехмерные структуры ткани могут быть реконструированы из данных при субклеточном разрешении. Техника восходит к работе Граттона, Кенига, Мастерс, Со и Тромберга, которые показали, что двухфотонное изображение клеток in vivo и, особенно, кожи человека, возможно без ущерба для жизнеспособности тканей. Благодаря сочетанию суб-микрометрового разрешения и оптического сечения с методом FLIM, морфологическая информация объединяется с биохимической и метаболической информацией.
Пример многофотонного FLIM человеческой кожи различной глубины показан на рисунке ниже. Верхний ряд изображений показывает роговой слой, то есть самый верхний слой кожи. В нижнем ряду показан слой спинозума, примерно на 50 мкм ниже поверхности.
Рис. 1. Разрешенные по времени аутофлуоресцентные изображения in vivo человеческого рогового слоя и спинного слоя. Слева направо: быстрая составляющая времени жизни t1, медленная составляющая времени жизни t2, отношение составляющих времени жизни t1/t2 и отношение амплитуд a1/a2. Указанный диапазон параметров соответствует цветовой гамме от синего до красного. Данные предоставлены Karsten König и Iris Riemann, Университет Саарбрюккена.
Инструменты для клинического использования были разработаны компанией Jenlab, Германия. Приборы одновременно регистрируют флуоресценцию в нескольких интервалах длин волн. Оптический принцип - это принцип многофотонного микроскопа с внешним детектированием (геометрия non-descanned). Флуоресцентный свет, собираемый линзой микроскопа, разделяемый дихроичным зеркалом, разделяется на несколько спектральных компонентов дихроичными зеркалами и детектируется несколькими детекторами. Данные FLIM записываются одним или несколькими платами счета фотонов TCSPC FLIM от Becker&Hickl. Ранее в приборах использовался одиночный модуль SPC‑830 TCSPC FLIM с маршрутизатором. Позднее приборы были модернизированы более современными параллельными системами TCSPC SPC‑153 (трехканальными) для записи с более высокими скоростями счета и, таким образом, для достижения более коротких времен сбора данных. Общий принцип показан на рисунке ниже.
Рис. 2. Схема прибора.
Изображение рогового слоя человека-добровольца, записанное с помощью этой системы, показано на следующем рисунке. Длина волны возбуждения составляла 750 нм. Левое изображение было записано в диапазоне длин волн излучения NAD(P)H, правое - в диапазоне излучения меланина.
Рис. 3. FLIM гранулярного слоя на предплечье человека-добровольца. Слева: NAD(P)H. Справа: меланин. Данные предоставлены Вашингтоном Санчесом и Майклом Робертсом, Университет Квинсленда, Брисбен, Австралия.