Функция затухания флуоресценции NAD(P)H является показателем того, выполняет ли клетка окислительный (окислительное фосфорилирование) или восстановительный метаболизм (гликолиз). Источником изменения является сдвиг в соотношении связанной и несвязанной NAD(P)H. Связанные и несвязанные фракции имеют разные времена жизни флуоресценции, что, в свою очередь, вызывает изменение профиля кривой затухания флуоресценции, смотри рисунок ниже.
Рис. 1. Поведение при затухании флуоресценции NAD(P)H в нормальных и гликолитических клетках.
В здоровых клетках метаболизм в основном окислительный, в раковых клетках он восстановительный. Поэтому форма кривой затухания флуоресценции, в частности отношение a1/a2, является параметром различения между нормальными клетками и раковыми клетками. К сожалению, метаболическое состояние также меняется с поступлением кислорода. В условиях гипоксии нормальная клетка может переключить свой метаболизм на гликолиз и ведет себя подобно раковой клетке. Поэтому желательно иметь доступную методику, которая отслеживает концентрацию кислорода (или парциальное давление кислорода, pO2) во время NAD(P)H FLIM.
Задача может быть решена путем использования фосфоресценции в качестве чувствительной функции pO2. Одновременная технология FLIM / PLIM от Becker&Hickl используется для одновременной регистрации флуоресценции NAD(P)H и фосфоресценции кислородного сенсора. Техника основана на дополнительной модуляции последовательности импульсов возбуждения и построении двух фотонных распределений. Распределение FLIM получается из времен фотонов в периоде импульса возбуждения, распределение PLIM из времен в периоде модуляции. Принцип иллюстрируется на рисунке ниже.
Рис. 2. Принцип одновременной техники FLIM / PLIM.
Типовой результат показан на следующем изображении. Клетки дрожжей окрашивали фосфоресцентным красителем на основе рутения. Затем клетки визуализировали с помощью процесса FLIM / PLIM, описанного выше.
Рис. 3. NADH FLIM и рутениевые PLIM изображения NAD(P)H