Мультифотонная сканирующая FLIM система DCS-120 MP

В FLIM системах компании Becker&Hickl используется многомерный коррелированный по времени процесс однофотонного счета в сочетании с конфокальным или многофотонным лазерным сканированием. Исследуемый образец непрерывно сканируется импульсным лазерным лучом с высокой частотой повторения, происходит детектирование отдельных фотонов сигнала флуоресценции, и каждый фотон характеризуется своим временем прихода в периоде лазерного импульса и координатами лазерного пятна в области сканирования в момент его регистрации. Процесс записи создает распределение фотонов по этим параметрам, см. рис. 1. Распределение фотонов можно интерпретировать как массив пикселей, каждый из которых содержит полную кривую затухания флуоресценции в большом количестве временных каналов.

Рис. 1: Принцип TCSPC FLIM

Процесс записи обеспечивает почти идеальную эффективность регистрации фотонов, отличное временное разрешение и не зависит от скорости сканера. Отношение сигнал/шум зависит только от общего времени регистрации и скорости фотонов доступных из образца. Метод может быть расширен путем включения дополнительных параметров в распределение фотонов. Это могут быть глубина фокуса в образце, длина волны фотонов, время после стимуляции образца, или время в течение периода дополнительной модуляции лазера. Эти методы используются для записи Z-стеков или мозаичных FLIM изображений, многоволновых FLIM изображений, изображений физиологических эффектов, возникающих в образце, или для одновременной записи изображений времени жизни флуоресценции и фосфоресценции.

Принцип работы сканера показан на рис. 2 (см. следующий пункт "Конфокальное сканирование"). Два лазерных луча подведены к сканеру. Они собираются объединителем лучей, проходят через главный светоделитель и отклоняются сканирующими зеркалами. Сканирующая линза направляет луч по траектории луча микроскопа таким образом, чтобы ось сканирующего зеркала проецировалась в заднюю апертуру объектива микроскопа. Движение сканирующих зеркал вызывает переменный наклон луча в плоскости объектива микроскопа. Таким образом, лазер сканирует область изображения в фокальной плоскости объектива микроскопа. Сканирование может быть очень быстрым - время строки может составлять до миллисекунды, весь кадр может быть отсканирован менее чем за секунду.

Флуоресцентный свет собирается обратно через объектив микроскопа, проходит через сканирующую линзу и снова отражается на сканирующих зеркалах. Отраженный луч неподвижен независимо от движения сканирующих зеркал. Он разделен на две спектральные или поляризационные компоненты и спроецирован в конфокальные точечные отверстия пинхолла. Световые сигналы, проходящие через точечные отверстия, спектрально фильтруются и отправляются на детекторы. Только свет от возбужденного пятна в фокальной плоскости объектива микроскопа достигает детекторов. В результате получается четкое изображение с определенной глубины внутри образца, без размытия в фокусе и бокового рассеяния.

Рис. 2: Оптическая схема сканирующей головки FLIM системы DCS-120

Сканирующая FLIM система DCS-120 имеет модульную конструкцию. Сканирующая головка DCS-120 совместима с обычными микроскопами практически любого типа и производителя. Полностью готовые к использованию FLIM системы с лазерным сканированием доступны с микроскопами Zeiss, Nikon и Olympus. Система DCS-120 MACRO сканирует макроскопические объекты непосредственно в плоскости изображения сканирующей головки. Система DCS может использоваться с различными лазерами и детекторами. Она может работать с пикосекундными диодными лазерами с различной длиной волны возбуждения, с перестраиваемыми лазерными источниками и с фемтосекундными лазерами для многофотонного возбуждения.

В варианте сканирующей FLIM системы DCS-120 MP используется двухфотонное возбуждение перестраиваемым титан-сапфировым лазером. Из-за нелинейной природы двухфотонного процесса возбуждение происходит только в ограниченном слое вокруг фокальной плоскости объектива микроскопа. Двухфотонное возбуждение имеет несколько преимуществ по сравнению с однофотонным возбуждением: во-первых, длина волны лазера находится в ближней ИК области спектра, где коэффициенты поглощения и рассеяния являются низкими. Следовательно, можно возбудить флуоресценцию в глубоких слоях исследуемого образца. Во-вторых, флуорофоры с длинами волн возбуждения в УФ области спектра могут быть достигнуты без необходимости в использовании УФ оптики. В-третьих, поскольку возбуждение происходит только в фокальной плоскости объектива микроскопа, фотохимические эффекты в образце уменьшаются. Четвертое преимущество состоит в том, что свет, рассеянный на выходе из образца, может эффективно регистрироваться без ухудшения качества получаемого изображения.

Двухфотонное возбуждение происходит только в тонком слое вокруг фокальной плоскости объектива микроскопа. Следовательно, для подавления детектирования несфокусированной флуоресценции не требуется точечных отверстий пинхолла. Следовательно, нет необходимости отправлять флуоресцентный свет от образца обратно через сканер на детекторы. Вместо этого флуоресценция отделяется от возбуждения непосредственно за объективом микроскопа и направляется непосредственно на детекторы. В результате даже фотоны, рассеянные на выходе из образца, имеют шанс достичь детекторов. Тот факт, что рассеянные фотоны детектируются, не влияет на качество получаемого изображения - система сбора данных автоматически присваивает им положение x-y лазерного луча, а не положение, в котором они покинули образец. Результатом является высокое качество изображения и высокая эффективность регистрации флуоресценции глубоких слоев образца. Принцип показан на рис. 3.

Рис. 3: Сканирование с 2-фотонным возбуждением. Детекторы без десканирования показаны справа от микроскопа

Однофотонные возбуждения, двухфотонные возбуждения и детекторы с десканированием и без дексканирования могут быть объединены в одну систему.

В сканирующих FLIM системах DCS-120 компании Becker&Hickl используется программное обеспечение сбора данных SPСM. С 2013 года программное обеспечение SPCM доступно в 64-битной версии. ПО SPCM 64 бит использует все возможности Windows 64 бит, что обеспечивает более быструю обработку данных, возможность записи изображений с чрезвычайно большим числом пикселей и наличие дополнительных многомерных режимов FLIM. Основная панель программного обеспечения сбора данных SPCM настраивается пользователем. Различные конфигурации программного обеспечения SPCM для FLIM систем компании Becker&Hickl показаны на рис. 4.

Рис. 4: Панель программного обеспечения SPCM. С левого угла вверху до правого угла внизу: FLIM с двумя детекторными каналами, мультиспектральный FLIM, комбинированное отображение времени жизни флуоресценции/фосфоресценции (FLIM/PLIM), корреляция флуоресценции (FCS), Z-стэк FLIM, мультиплексированный FLIM с длиной волны возбуждения.

С 64-битным программным обеспечением SPСM число пикселей можно увеличить до 2048x2048 пикселей с временным разрешением 256 временных каналов. Изображения показаны на рис. 5 и рис. 6.

Рис. 5: Образец BPAE (Invitrogen), отсканированный с разрешением 2048x2048 пикселей. Зеленый канал, от 485 до 560 нм

Сканирующая система DCS-120 для визуализации флуоресценции способна одновременно записывать два изображения с высоким разрешением в каналах с различной длиной волны или поляризации, см. рис. 5 и рис. 6. Запись выполняется в двух полностью параллельных TCSPC каналах, избегая любых электронных помех времени жизни или интенсивности флуоресценции. Даже если один канал насыщает другой, он все равно выдает правильные данные. Возможность записи изображений с большим числом пикселей удобна для широкого спектра приложений FLIM. Одним из примеров является визуализация ткани, где образцы большие, а изображения содержат множество деталей. Это также полезно, когда необходимо исследовать большое количество клеток и сравнивать результаты FLIM. Мегапиксельная FLIM визуализация записывает изображения множества клеток одновременно и в точно идентичных условиях окружающей среды. Кроме того, данные анализируются в одном процессе записи с одинаковыми IRF и подходящими параметрами. Поэтому результаты в точности сопоставимы для всех клеток, находящихся в области изображения.

Рис. 6: Образец BPAE (Invitrogen), отсканированный с разрешением 2048x2048 пикселей. Красный канал, от 560 до 650 нм

Мозаичный FLIM записывает большое количество последовательных изображений в один массив данных FLIM. Отдельные изображения в этом массиве могут представлять элементы сканирования в виде плитки (мозаика x-y), изображения с различной глубиной в образце (мозаика z-стека) или изображения в разное время после стимуляции образца (временная мозаика). Пример мозаики x-y показан на рисунке 7. Полный массив данных имеет размер 2048x2048 пикселей и 256 временных каналов на пиксель. По сравнению с аналогичным изображением, полученным через объектив с небольшим увеличением, преимущество мозаичного FLIM заключается в том, что можно использовать объектив с высокой числовой апертурой, что обеспечивает высокую эффективность обнаружения и высокое пространственное разрешение.

Рис. 7: Мозаичный FLIM образца ландыша майского (Convallaria). Мозаика имеет 4x4 элемента, каждый элемент имеет 512x512 пикселей с 256 временными каналами. Вся мозаика имеет размер 2048х2048 пикселей, каждый пиксель содержит 256 временных каналов. Использовалась многофотонная система DCS-120 MP с моторизованным предметным столиком.

Управление сканером полностью интегрировано в программное обеспечение сбора данных SPСM. Коэффициент масштабирования и положение области сканирования можно регулировать с помощью панели управления сканера или с помощью курсоров окна дисплея. Изменения параметров сканирования выполняются в режиме онлайн, без остановки сканирования. Что бы Вы не изменяли в микроскопе: положение образцов, область сканирования, коэффициент масштабирования, фокальная плоскость, размер точечного отверстия или мощность лазера - результат сразу становится виден на изображениях предварительного просмотра.

Рис. 8: Интерактивное управление сканером

В зависимости от формата кадра и коэффициента масштабирования, блок управления сканером DCS-120 автоматически выбирает максимальную скорость сканера. Таким образом, сканер всегда работает с высокой частотой пикселей, что приводит к быстрому обнаружению, минимальному триплетному возбуждению и минимальному фотообесцвечиванию исследуемого образца

Часто используемые конфигурации прибора сохраняются на панели «Предустановленные настройки». Переключение между различными конфигурациями и пользовательскими интерфейсами осуществляется одним щелчком мыши.

Рис. 9: Переключение между различными конфигурациями прибора: FLIM система DCS-120 переключается из конфигурации FLIM в конфигурацию FCS одним щелчком мыши

Когда FLIM визуализация применяется к живым образцам, время и экспозиция, необходимые для позиционирования образца, фокусировки, регулировки мощности лазера и выбора интересующей области, сводятся к минимуму. Поэтому системы FLIM имеют функцию быстрого предварительного просмотра. Функция предварительного просмотра отображает изображения с интервалами порядка 1 секунды и менее, см. Рис. 10.

Рис. 10: Программное обеспечение SPCM в режиме быстрого просмотра, скорость отображения одного изображения в секунду.

Начиная с версии 9.72 программного обеспечения SPСM, FLIM система DCS-120 способна отображать изображения времени жизни в режиме онлайн как во время накопления данных FLIM, так и для отдельных этапов быстрой последовательности изображений. Изображения живых клеток могут отображаться со скоростью, равной 10 изображениям в секунду. Расчет времени жизни изображений основан на первом моменте данных затухания в пикселях изображений. Техника первого момента сочетает в себе короткое время расчета с почти идеальной эффективностью фотонов. Важно отметить, что для достижения высокой скорости вычислений не требуется уменьшать временное разрешение (количество каналов на пиксель). Даже если во время сбора данных FLIM используется функция быстрого онлайн-времени жизни, данные впоследствии могут быть обработаны с помощью точного многоэкспоненциального анализа данных SPCImage.

Рис. 11: FLIM изображения размером 256x256 пикселей, полученные с помощью функции онлайн-отображения FLLIM. Время опроса 0.2 с, 0.5 с и 2 с.

FLIM система DCS-120 использует быстрое сканирование луча с помощью гальванометрических зеркал. Полный кадр сканируется за время от 100 мс до нескольких секунд с временем задержки пикселя до одной микросекунды. По сравнению со сканированием образца сканирование лазерным лучом не только намного быстрее, но оно также позволяет избежать индукции движения клетки путем воздействия на образец динамических сил. Кроме того, для визуализации живых клеток требуется функция быстрого предварительного просмотра для позиционирования и фокусировки образца. Это может быть обеспечено, только если луч сканируется с высокой частотой кадров. Благодаря быстрому сканеру и многомерному TCSPC процессу FLIM система DCS-120 достигает удивительно короткого времени сбора данных, см. Рис. 12.

Рис. 12: FLIM-изображения, записанные в течение 5 секунд. Изображения размером 256x256 пикселей (слева) и 512x512 пикселей (справа), оба изображения с 256 временными каналами.