Особенности:
- Улучшенное латеральное разрешение: 170 нм;
- Разрешение с деконволюцией: 120 нм;
- Квантовая эффективность: до 95% (VIS);
- Скорость: 1-2 к/с (512х512 пикс.);
- Открытая архитектура системы;
- Высокая чувствительность и низкий шум;
- Доступная стоимость.
Оптический модуль RCM компании Confocal.nl для конфокальной микроскопии представляет собой систему модернизации существующего широкопольного флуоресцентного микроскопа в лазерную конфокальную систему сверхвысокого разрешения для применения в микроскопии. RCM - это доступная система конфокальной визуализации, представляющая собой идеальное решение для небольших лабораторий с ограниченным бюджетом, но высокими требованиями к качеству. Этот модуль является отличным дополнением к имеющимся средствам визуализации для расширения их функциональных возможностей.
Чтобы продемонстрировать улучшение качества изображения с помощью RCM, были сделаны изображения одной и той же клетки из образца кожи оленя, используя широкопольный микроскоп, обычный конфокальный микроскоп и RCM. Изображение, полученное с помощью RCM, было улучшено с помощью деконволюции. Смотрите разницу:
Образец кожи оленя. Вверху: изображение полного поля зрения; внизу: увеличенная область.
Детали эксперимента:
|
Метод |
Микроскоп |
Объектив |
Детектор |
Точечная диафрагма |
|
Широкопольная микроскопия |
Zeiss Axiovert 200M |
63x
|
PCO sensicam
| |
|
Конфокальная микроскопия |
Nikon A1 |
60x
|
GaAsP ФЭУ |
1 AU |
|
RCM |
RCM +
|
100x
|
Hamamatsu
|
1 AU |
Конфокальная визуализация - RCM имеет улучшенное латеральное разрешение и такое же аксиальное разрешение по сравнению с обычным конфокальным микроскопом;
Визуализация живых клеток - RCM имеет очень высокое отношение сигнал/шум и квантовую эффективность (80-95%, в зависимости от камеры), что означает отсутствие необходимости в использовании лазера высокой мощности;
Приложения для обработки изображений и многоцветных изображений - RCM может работать в многоцветном режиме для различных цветовых комбинаций (такие приложения, как FRET, FRAP, pH и Ca2+ визуализация).
|
Модули |
RCM1 |
RCM2 |
NL5 |
|
Детектор |
Камера |
Камера |
Камера |
|
Разрешение |
120 нм ** |
120 нм ** |
170 нм ** |
|
Чувствительность |
до 95% QE |
до 95% QE |
до 95% QE |
|
Поле обзора |
130×130 мкм (60x, сверхвысокое разрешение) |
220×220 мкм (40x, сверхвысокое разрешение) |
330×330 мкм (40x, увеличение) |
|
Система оптимизирована для |
100x, 60x (высокая NA) |
100x, 60x, 40x (высокая NA) |
40-100x |
|
Сканнер |
Аналоговый (без ОС) |
Цифровой (с ОС) |
Цифровой (с ОС) |
|
Скорость |
1 к/с @ 512 x 512 пикс. |
2 к/с @ 512×512 пикс. |
25 к/с полный кадр |
|
Длина волны |
Видимый или ближний ИК диапазон |
Видимый или Видимый+ближний ИК диапазон (RCM2.5) |
Видимый диапазон |
|
ПО |
Micromanager, NIS Elements, Volocity |
Micromanager, Volocity, NIS Elements, Zen, LAS X, Cellsens |
Micromanager, Volocity, NIS Elements |
|
Интеграция |
API |
Аппаратное обеспечение — USB-соединение |
API |
|
PSF для деконволюции с |
Microvolution, SVI Huygens |
Microvolution, SVI Huygens |
Microvolution |
|
Bypass режим |
Да |
Да |
Да (моторизированный) |
С ростом количества установленных в лабораториях RCM систем для конфокальной микроскопии расширяется и ассортимент различных объективов микроскопов и камер, используемых совместно с этой системой, т.к. во многих случаях RCM добавляется для модернизации уже существующей системы визуализации и позволяет получать конфокальные изображения высокого разрешения.
Если Вы смотрите на свой старый микроскоп, оборудованный Вашим любимым объективом и камерой, и задаетесь вопросом - можете ли Вы использовать то, что у Вас уже есть в наличии, в качестве основы для создания ре-сканирующего конфокального микроскопа, то эта информация именно для Вас!
В таблице ниже перечислены все типы объективов и камер, которые мы рекомендуем использовать с RCM ре-сканирующей конфокальной системой. Для типов объективов, не перечисленных ниже, улучшенное латеральное разрешение не будет достигнуто посредством принципа повторного сканирования. Также будет уменьшено аксиальное разрешение и мощность секционирования из-за несоответствия размера точечного отверстия RCM системы.
Рекомендации по выбору камеры для использования с RCM системой основаны на критериях выборки Найквиста, что позволяет достичь теоретическое разрешение в реальных изображениях с камеры. Можно использовать камеры, отличные от рекомендованных, но это может привести к достижению более низкого разрешения, чем указано ниже.
|
Объектив микроскопа |
Разрешение |
Размер пикселя |
Рекомендуемая камера | |||||
|
Увеличение |
Иммерсия |
Числовая апертура NA |
Латеральное разрешение RCM системы (при 550 нм) |
Требуемый размер пикселя камеры (выборка Найквиста) |
Flash4.0/Zyla4.2/ pco.edge4.2 (2048x2048; 6.5 мкм) |
Prime 95B (1200x1200; 11 мкм) |
iXon Ultra 888 (1024x1024; 13 мкм) |
897 (512x512; 16 мкм) |
|
100x |
масло |
1,45 |
165 нм |
12,4 мкм |
++ |
+ |
+/- |
+/- |
|
60x |
масло |
1,40 |
170 нм |
7,7 мкм |
+ |
- |
- |
- |
|
60x |
вода |
1,20 |
200 нм |
9,0 мкм |
+ |
+/- |
- |
- |
|
60x |
сухой |
0,95 |
250 нм |
11,4 мкм |
++ |
+ |
+/- |
- |
|
40x |
сухой |
0,95 |
250 нм |
7,6 мкм |
+ |
- |
- |
- |
Примечание:
++ Рекомендуемая (избыточная дискретизация);
+ Рекомендуемая;
+/- Может использоваться, но не рекомендуется;
- Не рекомендуется.
RCM - это доступная по стоимости и чувствительная ре-сканирующая конфокальная система визуализации высокого разрешения:
- идеальное решение для небольших лабораторий с ограниченным бюджетом, но требующих решения задач, при которых особенно необходима высокая чувствительность и разрешение системы визуализации,
- отличное дополнение к средствам обработки получаемых изображений для увеличения возможностей визуализации в микроскопии,
- конфокальная система RCM чрезвычайно проста в использовании - не требуется аппаратное управление или программная обработка.
Ре-сканирующая конфокальная система RCM представляет собой апгрейд для существующей широкопольной флуоресцентной системы, которую можно легко добавить к микроскопу для улучшения его разрешения.
Стандартное разрешение ре-сканирующей конфокальной системы RCM составляет 170 нм при длине волны возбуждения 488 нм, что также называется сверх-разрешением. В отличие от других систем со сверхвысоким разрешением, RCM система предлагает сверхвысокое разрешение живого (необработанного) изображения без какой-либо дополнительной программной обработки. Деконволюция может быть использована для еще большего улучшения разрешения RCM системы до 120 нм.
Частота кадров RCM системы составляет 4 кадра/с при разрешении 512x512, что составляет время получения трехцветного изображения около 1 секунды!. Определенные задачи в микроскопии, требующие немного более быстрой обработки изображений или сокращения времени между различными цветами, могут быть решены путем перепрограммирования режима сканирования.
RCM - это стандартная конфокальная система, дополненная блоком визуализации, где пара сканирующих зеркал проецирует излучаемый свет прямо на камеру путем сканирования сенсора.
Помимо сверхвысокого разрешения с помощью метода повторного сканирования и высокой чувствительности благодаря использованию чувствительной sCMOS-камеры в качестве детектора, третьей важной особенностью RCM системы является ее гибкость.
Для фиксированных многоцветных образцов оптимальным по умолчанию режимом работы является режим последовательного покадрового сканирования. Кроме того, такие приложения как FRET, которые не нуждаются в высокой скорости визуализации (например, апоптоз HeLa клеток), могут лучше всего выполняться в этом режиме. Но для высокодинамичных биологических процессов временная задержка между разными цветами должна быть минимизирована, чтобы избежать изменения цвета.
Одним из решений, позволяющих уменьшить временную задержку между получением разных цветов, является формирование построчного многоцветного изображения путем мультиплексирования - одна и та же линия сканируется два (или более) раза с разными длинами волн возбуждения, характерными для флуорофора, и излучаемый свет направляется на ту же камеру, но каждый цвет проецируется на разные участки сенсора камеры. Таким образом, временная задержка между цветами уменьшается до порядка нескольких миллисекунд, а смещение между цветами становится незначительным.
Режим мультиплексирования может быть дополнительно оптимизирован с помощью выбора запирающего фильтра: двухполосный фильтр или комбинированный запирающий фильтр (производится исключительно для RCM системы), где разные части сенсора камеры покрыты разными однополосными запирающими фильтрами. Запирающий комбинированный фильтр уменьшит перекрестные помехи между оптическими каналами. Также возможно одновременное сканирование различных цветов в режиме реального времени. Для быстрых FRET измерений со сверхвысоким разрешением эта новая технология будет существенной.
Скорость конфокальной ре-сканирующей системы RCM ограничена скоростью сканирования зеркал. Некоторые приложения - например, исследование активности кальция, измерения рН-метрики, FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) требуют гораздо более высокой скорости визуализации. В этих приложениях можно отказаться от получения двумерной информации и отслеживать изменения интенсивности вдоль одной линии (1-мерной) с чрезвычайно высокой скоростью формирования изображения.
Таким образом, в дополнение к доступной цене, чувствительности и доступности сверхвысокого разрешения, гибкость RCM системы связанная с независимым управлением двумя парами сканирующих зеркал, предоставляет дополнительный потенциал для приложений, требующих высокоскоростной или быстрой многоцветной визуализации.
Клетки HeLa, экспрессирующие EB1, помечены YFP. Интервал времени 2 секунды, мощность лазера 8 мкВт (Андреас Курц).
Клетки НЕК 293, экспрессирующие два мембранных белка. Изображение - это максимальная проекция z-стека во времени. Образец предоставлен: Рувим Леви-Майерс, Университет Джонса Хопкинса, Балтимор, США.
Максимальная проекция Z-стека во времени. Гипокотильные клетки Arabidopsis, экспрессирующие GFP-EB1b - белок связывается с + концами микротрубочек и указывает на их рост (так называемое кометоподобное движение). EB1b также связывается с ядерной мембраной, что видно по высокоинтенсивным структурам. Образец предоставлен: Доктор С. Л. Шоу. Поступила на курс AQLM в MBL в Вудс-Хоул, штат Массачусетс, США.
|
RAW данные от RCM, 61 час съемки |
Преимущества деконволюции |
Клетки HO1N1, экспрессирующие митохондрии-RFP через систему экспрессии Bacmam. Съемка проводилась в режиме 1 изображение каждые 10 секунд в течение 61 часа (в общей сложности получилось почти 22 000 изображений!). Измеренная мощность лазера составляла 1 микроватт в плоскости образца. Фильм снят Джероеном Коле (Confocal.nl), образец любезно предоставлен Dandan Ma (ACTA, Амстердам), оборудование предоставлено Марко Поповичем (Центр повышения квалификации Nikon, Медицинские центры Амстердамского университета, VUmc, Амстердам).
Распространение ядер из фиксированных сперматоцитов мыши (метка Alexa 488). Фото получены с помощью RCM без повторного сканирования (конфокальный режим) и с повторным сканированием (RCM). Слева: полный спред. Справа: отдельные хромосомы.
Митотическая клетка - линия клеток Cos7 с антителами, которые метят ядро (синий), митохондрии (зеленый) и тубулин (красный). Исходное изображение RCM (слева) и результат деконволюции элементов NIS (справа).
Клетки нейробластомы N1E-115. Слева необработанное изображение из RCM, справа то же самое изображение после деконволюции Microvolution.
Ре-сканирующая конфокальная микроскопия (RCM) - это новый метод получения сверхвысокого разрешения, основанный на традиционной конфокальной микроскопии, расширенной с помощью оптического (повторно сканирующего) устройства, которое проецирует изображение непосредственно на сенсор EMCCD или sCMOS камеры. Такая система модернизации флуоресцентного микроскопа в конфокальный имеет более высокое латеральное разрешение (170 нм при возбуждении лазером с длиной волны 488 нм) и значительно улучшенную чувствительность, сохраняя при этом возможности визуализации срезов стандартного конфокального микроскопа. Это особенно полезно для биологических применений, где требуется сочетание высокого разрешения и высокой чувствительности, но не очень быстрой скорости визуализации получаемого изображения.
Лазерное излучение (синие и желтые линии), возбуждающее флуоресценцию в исследуемом образце, направляются через дихроичное зеркало к первому сканирующему блоку SM1. Как и в стандартном конфокальном микроскопе, сканирующий блок направляет лазерное излучение в образец для его сканирования и отражает испускаемое флуоресцентное излучение, направляя его на точечную диафрагму PH – пинхол (зеленые и красные линии). После точечной диафрагмы второй модуль SM2 повторного сканирования направляет свет на сенсор камеры.
Во время сканирования зеркала блока повторного сканирования (SM2) перемещаются быстрее, чем зеркала первого блока сканирования (SM1). Это увеличивает изображение на сенсоре камеры по сравнению с реальными размерами исследуемой области образца и в конечном счете приводит к достижению более высокого разрешения получаемого изображения. Разрешение системы улучшается с шагом повторного сканирования в √2 (т.е. в 1,41 раза) по сравнению с пределом разрешения Аббе путем изменения угловой амплитуды перемещения зеркала блока повторного сканирования (SM2). Для увеличения разрешения больше не нужно уменьшать диаметр отверстия пинхола. Закрытие отверстия пинхола ограничивает только количество проходящего света и уменьшает отношение сигнал/шум из-за более слабого сигнала. Поскольку повторное сканирование является чисто оптическим методом, не требующим дополнительной электронной обработки изображения, требуется больше затраченного времени на улучшение разрешения. При использовании в качестве детектора чувствительной камеры отношение сигнал/шум ре-сканирующей конфокальной микроскопии в 4 раза выше, чем при стандартной конфокальной микроскопии.
Заказ можно сделать следующим образом:
Товар бывает в наличии на нашем складе в РФ крайне редко. Из-за высокой стоимости и специфических характеристик высокотехнологического оборудования в большинстве случаев оно отсутствует и на складе самого производителя, так как производится под конкретный заказ.
Недорогие расходные материалы и дополнительные комплектующие, пользующиеся популярностью, производятся в значительном количестве и могут быть отправлены нам нашими поставщиками в течение пары дней после получения оплаты по инвойсу.
Срок поставки оборудования зависит от 3 факторов:
1. Наличие товара на складе производителя и срок его производства;
Если товара нет на складе производителя, срок производства высокотехнологичного оборудования, как правило, составляет от трех до шести недель. Производство сложных комплексных систем может занимать больше времени.
2. Время на доставку груза в РФ;
Срок доставки груза в РФ зависит от его веса и габаритов. Если груз небольшой, то он летит самолетом, что занимает один-три дня до таможенного склада. Если вес груза измеряется сотнями килограммов, то он плывет кораблем в пределах месяца.
3. Срок прохождения таможенного контроля.
Данный этап занимает до 10 дней. В случае непредвиденных обстоятельств процесс таможенного оформления может затянутся на месяц и больше.
Срок поставки комплектующих Thorlabs занимает от 4 недель.
В стоимость товара будет входить цена производителя, стоимость доставки, таможенные сборы и НДС. Цена в рублях также зависит от колебаний курса.
