Миниатюрный флуоресцентный микроскоп Miniscope V4

График эксперимента:

Планируйте график эксперимента соответствующим образом. Вот типовой график подготовки мышей к экспериментам со свободно движущимися животными.

Неделя 1: вирусная инъекция в животного;

Неделя 2: имплантация GRIN линз в мозг животного;

Неделя 3: восстановление животного после операции;

Неделя 4: хирургическая операция по креплению опорной пластины на череп животного и привыкание к экспериментаторам/обработка;

Неделя 5: привыкание животного к ношению минископа на голове и настройка фокальной плоскости получаемого изображения;

Неделя 6: начало эксперимента!

Привыкание к экспериментаторам/обработка:

Обычно нужно подождать по крайней мере один день после хирургической операции по установке опорной пластины на череп животного, чтобы начать обработку. Мы рекомендуем, чтобы мыши хорошо адаптировались к экспериментаторам перед установкой минископов. Важно, чтобы мыши чувствовали себя комфортно с экспериментаторами, так как стресс во время установки минископа во время эксперимента может вызвать неблагоприятные последствия для мышей и, следовательно, проведения эксперимента. После осторожного обращения с животными несколько раз, приучите мышей к тому, чтобы что-то было надето на их головы и снято с них, осторожно надев защитные крышки на их опорную пластину, которая закреплена на головах мышей. Экспериментаторы должны быть в состоянии быстро снять защитную крышку без особых усилий со стороны животного, прежде чем перейти к фазе привыкания.

Привычка к ношению минископов:

Как только мышам (и экспериментаторам) будет удобно снимать защитную крышку, приучите мышей к ношению минископов при свободном движении. Чтобы привыкнуть, один экспериментатор должен спокойно удерживать мышь и снять крышку, в то время как второй экспериментатор заменяет крышку на минископ. Минископ должен легко встать на свое место с помощью магнитов. Второй экспериментатор должен аккуратно держать стороны опорной пластины с одной стороны, при закреплении минископа установочным винтом с другой стороны. Особенно в первый раз животное может бороться. Если животное слишком много борется, отпустите и успокойте животное. Если животное сопротивляется и борется слишком много, пока вы держитесь за опорную пластину, это может привести к тому, что зубной цемент, удерживающий опорную пластину, оторвется от черепа. Когда животное успокоится, попытайтесь удерживать опорную пластину и вставить установочный винт, чтобы снова закрепить минископ. Как только минископ будет закреплен, позвольте животному исследовать привычную среду обитания (клетку). Обычно нужно позволить мышам свободно передвигаться в домашней клетке (даже если в клетке есть другие мыши). В зависимости от ваших экспериментальных требований, вам нужно привыкнуть к различным вариантам движения животного. Если для эксперимента нужны только мыши, чтобы ходить и исследовать их, то мы рекомендуем привыкать не менее 3 дней по 10 минут каждый день. Если эксперимент требует, чтобы мыши бегали быстро (например, по линейной дорожке), то мы рекомендуем привыкать в течение по крайней мере 5 дней по 10-30 минут каждый день.

Настройка фокальной плоскости изображения и интенсивности светодиодов:

Мы рекомендуем установить фокальную плоскость изображения и интенсивность светодиода до начала эксперимента. Это может быть сделано во время сессий по привыканию животного. Перемещайте ползунок фокусировки вдоль рамы корпуса минископа, пока не достигнете оптимальной фокальной плоскости мозга. Чтобы установить фокальную плоскость, затяните установочный винт в ползунке фокусировки, пока ползунок фокусировки не будет закреплен. Будьте осторожны с чрезмерной затяжкой, так как винт может сделать углубления в пластиковом материале горловины корпуса. После того, как фокальная плоскость установлена, не меняйте ее во время эксперимента, если вам необходимо отобразить один и тот же набор клеток в течение сеанса. Как правило, мы обнаружили, что некоторые мыши могут использовать один и тот же минископ в определенной фокальной плоскости. Однако другим мышам может понадобиться установить минископ на другую высоту.

Во время этого сеанса вы также можете найти оптимальный уровень интенсивности светодиодов для визуализации. Убедитесь, что синего света достаточно, чтобы увидеть как флуоресцируют клетки, так и некоторые кровеносные сосуды, которые можно использовать в качестве ориентиров для выравнивания кадров. Мы рекомендуем снять видео во время привычного сеанса с вашими настройками и проанализировать видео, чтобы убедиться, что настройки оптимальны до начала эксперимента. Кроме того, сделайте снимок мозга, который вы будете использовать для ссылки на все будущие сеансы визуализации. Таким образом, вы можете начать свой эксперимент с уверенностью и легкостью!

Начало эксперимента:

Ниже приведен пример контрольного списка, который можно использовать для начала эксперимента:

- Убедитесь, что на жестком диске вашего компьютера достаточно места для файлов данных, которые будут собираться в течение всего эксперимента. Если вы используете поведенческую камеру, не забудьте также включить ее.

- Проверьте и очистите датчик изображения, прежде чем прикручивать его к ползунку фокусировки. Если есть пыль или грязь, используйте мягкую салфетку для протирки линз и спирт, чтобы аккуратно очистить датчик. Обычно это нужно сделать только один раз, прежде чем закрепить на ползунке фокусировки. Если датчик изображения снимается между сеансами экспериментам, то обязательно привинтите его обратно к ползунку фокусировки в той же ориентации!

- Подключите кабель минископа к DAQ плате, подключите кабель USB 3.0 к DAQ плате и компьютеру и откройте приложение Miniscope Control на вашем компьютере.

- Убедитесь, что 3 светодиодных индикатора на DAQ плате включаются, и горит красный индикатор на минископе.

- Убедитесь, что минископ находится на одном уровне с опорной пластиной или как можно выше и минископ не перекошен и установочный винт не мешается.

- Сравните живое изображение, которое вы видите, со снимком той же области мозга, который вы сняли во время этапа привыкания животного. Попробуйте сопоставить его как можно лучше. Кровеносные сосуды, контрастность, яркость изображения должны выглядеть одинаково. Если это не так, выясните, почему это не так.

- Аккуратно затяните установочный винт, чтобы закрепить минископ на опорной пластине. Остановитесь, как только винт вступит в контакт с пластиковым корпусом минископа. Чрезмерная затяжка сделает углубление в пластиковом корпусе и приведет к его повреждению. Для того, чтобы проверить, что минископ безопасно закреплен, аккуратно покачайте и потяните минископ при прикреплении к опорной пластине, наблюдая томографию мозга. Перемещение минископа не должно вызывать движения изображения на видео.

- Убедитесь, что у кабеля достаточное провисание и он не натянут, чтобы мыши могли свободно двигаться, но не настолько, чтобы мыши могли пережевывать кабель. Если вы не используете коммутатор, обратите внимание на возможное скручивание кабелей во время движения животных.

- Убедитесь, что скорость записи компьютера превышает скорость кадров регистрируемых изображений.

- После проведенного эксперимента визуально проверьте эту папку данных, чтобы убедиться, что данные были сохранены правильно.

- Сделайте резервную копию ваших данных!!!