Введение
Оптический модуль Clarity HS от компании Aurox использовался для записи и сравнения широкопольных, конфокальных и конфокальных с высоким разрешением изображений фибробластов исследуемой мыши NIH3T3 (рисунок 1).
Рис. 1 Конфокальное изображение сверхвысокого разрешения, полученное с помощью модуля Clarity HS Aurox без использования лазерного излучения
Эксперимент
Было приготовлено предметное стекло с множеством лунок неподвижного фибробласта мыши NIH3T3, где первичное антитело было α-тубулин, а вторичное антитело соединялось с флуорохромом Alexa Fluor 488.
Конструкция установки состояла из конфокального оптического модуля Clarity HS от компании Aurox, не требующего использования лазера, подключенного к инвертированному микроскопу Nikon Ti-E, с использованием масляного иммерсионного объектива 63х-кратным увеличением и апертурой 1.4NA. К оптическому модулю Clarity HS был дополнительно подключен светодиодный источник света pЕЗОО Ultra компании CoolLED, sCMOS камера Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 и куб с оптическими фильтрами GFP-LED Aurox (например, возбуждающий фильтр 466 нм, эмиссионный фильтр 525 нм).
|
График 1. Профиль линии среза широкопольного изображения |
Рис. 2 Широкопольное изображение фибропласта мыши |
Первым было получено широкопольное изображение (рисунок 2), используя оптический модуль Clarity HS со временем экспозиции 200 мс. Программное обеспечение Aurox Visionary и модуль Clarity HS затем использовались для автоматической записи одноканального временного ряда из 100 конфокальных изображений при секционировании 0,9 и времени экспозиции 200 мс. Затем изображения одним нажатием компьютерной мыши автоматически экспортировались в программное обеспечение ImageJ/Fiji с помощью функции экспорта Aurox Visionary. Первый конфокальный кадр этого временного ряда показан на рисунке 3.
|
График 2. Профиль линии среза конфокального изображения |
Рис. 3 Конфокальное изображение фибропласта мыши |
Свободно доступный аналитический метод с открытым исходным кодом с радиальными флуктуациями сверхвысокого разрешения (SRRF), реализованный в программном обеспечении ImageJ/Fiji, был затем применен к временному ряду из 100 кадров с использованием настроек SRRF по умолчанию. Полученное в результате конфокальное изображение сверхвысокого разрешения без использования лазерного излучения показано на рисунке 4.
|
График 3. Профиль линии среза конфокального изображения сверхвысокого разрешения |
Рис. 4 Конфокальное изображение фибропласта мыши сверхвысокого разрешения |
Затем визуально сравнивали широкопольные, конфокальные и конфокальные изображения со сверхвысоким разрешением, и графики участков профиля линии среза 1-3 создавали в областях, указанных на рисунках 2-4.
Результаты
Как и ожидалось, конфокальные изображения, полученные без использования лазерного излучения демонстрируют значительное более высокое качество картинки по сравнению с широкопольным изображением благодаря удалению несфокусированного сигнала и значительно повышенному контрасту, что позволяет лучше определить детали структуры изображения, как показано на графике 2 и на рисунке 3. Применение SRRF анализа для обработки конфокальных изображений полученных без использования лазерного излучения может обеспечить более высокое разрешение и более точные детали изображения, как показано на графике 3 и рисунке 4.
Выводы
Конфокальный оптический модуль без использования лазерного излучения Clarity HS от компании Aurox является отличным инструментом для записи высококачественных конфокальных изображений простым и доступным способом. Простая запись 100 кадров изображений за несколько десятков секунд и использование свободно доступных инструментов постобработки, таких как SRRF, позволяют получить изображения со сверхвысоким разрешением без необходимости применения дорогостоящего и сложного в использовании оборудовании и программного обеспечении для конфокальной микроскопии.
