3D сканирование областей образца с мультифотонным микроскопом FEMTO3D Atlas

Одновременный доступ к нескольким регионам образца в 3D

• Высокая скорость: Запись изменений флуоресценции с частотой до 30 кГц в объеме 500 x 500 x 650 мкм3.
• Большой охват: одновременная визуализация более 2000 целей.
• Свобода выбора: гибкое управление формой и трехмерной ориентацией отсканированных областей.
• Точность: Более высокое отношение сигнал/шум (SNR) по сравнению с обычными микроскопами.

FEMTO3D Atlas — это сверхбыстрая платформа многофотонной визуализации, которая сочетает в себе трехмерную флуоресцентную съемку с трехмерной фотостимуляцией. От субмикронного масштаба до масштаба целых животных, микроскоп FEMTO3D Atlas обеспечивает максимальную гибкость для ваших полностью оптических экспериментов до 850 мкм вглубь образца. Унифицированная архитектура представляет собой высшую ценность для ученых, стремящихся к передовым исследованиям в области наук о жизни.

Основные характеристики, делающие микроскоп FEMTO3D Atlas наиболее подходящим для наук о жизни:

	Трехмерное сканирование области для визуализации сети, дендритов и позвоночника in vivo. Гибкое сканирование небольших областей интереса в 3D со скоростью в кГц и высоким отношением сигнал/шум.
	Технология 3D anti-motion для коррекции движения in vivo. Значительно улучшает качество сигнала изображения у свободно движущихся животных
	Высокоскоростное произвольное сканирование кадров с потенциалом для получения изображения в режиме voltage imaging. Произвольно вращайте кадры и сканируйте их с частотой 40 Гц без шума сканера.
	3D-фотостимуляция для оптогенетических исследований. Выполняйте одновременную фотостимуляцию и быструю визуализацию в 3D.

Органоиды, черви, мухи или мозг млекопитающих содержат трехмерные (3D) сети клеток, соединенных тонкими отростками. Визуализация таких сложных структур в действии, в частности обнаружение быстрых временных событий, происходящих одновременно в рассредоточенных местоположения в 3D (например, между шипами на нейронном дендритном дереве) можно эффективно выполнять с помощью режимов сканирования 3D-области микроскопа Atlas, ограничивая сканирование целевыми структурами и пропуская ненужные части образца. В отличие от обычных систем визуализации, которые вынуждены получать данные в последовательных двухмерных оптических срезах, поэтому они не оптимальны для доступа к трехмерным структурам в тканях.

Концепция трехмерного сканирования области, реализованная в микроскопах Atlas, представлена на рисунке 1. Первым шагом является поиск целевых структур в образце, т.е. нервных клеток в головном мозге. Трехмерные объемные данные должны быть собраны с образца, и Atlas эффективно поддерживает этот шаг за счет быстрого сбора z-стека. Вторым шагом в 3D-сканировании области является определение местоположения и формы целевых структур, подлежащих мониторингу на высоких скоростях, с частотой дискретизации до кГц. Atlas поддерживает вас в этом рабочем процессе благодаря автоматическому обнаружению клеток и ручному выбору филаментоподобных структур. После определения трехмерных местоположений и ориентации целевых областей данные флуоресценции могут быть получены с высокой скоростью. Программные инструменты, поставляемые с микроскопом Atlas, обеспечивают немедленную визуализацию и анализ данных.

Рис. 1. Трехмерное сканирование области, доступное с многофотонной платформой Atlas «все в одном». A: В живых организмах интересующие объекты рассредоточены в трехмерном пространстве. Синие объекты представляют собой целевые структуры, в которых необходимо зафиксировать быстрые временные изменения флуоресценции. Красные сферы в каждом объекте иллюстрируют «режим сканирования точки произвольного доступа» Atlas, который может регистрировать изменения флуоресценции в 3D со скоростью до 30 кГц. B: Обычный подход к покрытию трехмерных структур состоит в том, чтобы собрать стопку плоскостей с помощью оптического среза. В Atlas высокоскоростное сканирование кадров поддерживает получение стека. В этом примере показан объем 500 х 500 х 500 мкм3 из загруженной OGB1-AM зрительной коры мыши. C: Чтобы определить целевые местоположения для трехмерного сканирования области, в программном обеспечении Atlas предусмотрены методы автоматического обнаружения клеток. D: Результат трехмерного сканирования области. Изменения флуоресценции, отражающие активность концентрации Са2+ в 200 клетках, в зависимости от времени. E: клеточная активность визуализируется в виде цветных сфер в выбранном объеме.

При использовании сканирования областей Atlas 3D беспрецедентная скорость и гибкость, которые вы получаете для охвата многих структур, достигаются без какого-либо ущерба для качества сигнала. На рис. 2 показано, что 3D-сканирование области обеспечивает более высокое качество сигнала по сравнению с обычными сканерами, которые тратят значительное время на сбор сигнала за пределами целевых областей.

Рис. 2. Помимо скорости и гибкости мониторинга живых структур, трехмерное сканирование области также обеспечивает превосходное качество сигнала. Клетки из одной и той же кортикальной области мыши, экспрессирующей GCaMP6s, регистрировали с помощью обычного микроскопа на основе резонансного гальванопластики (слева) и в режиме сканирования области Atlas 3D (справа). Обратите внимание на значительное улучшение общего уровня шума при отслеживании активности с помощью сканирования области Atlas 3D (справа) по сравнению с сигналами, полученными из той же области с помощью обычного микроскопа. Оба микроскопа были настроены на сканирование 50 областей в поле зрения 500 х 500 мкм2 от зрительной коры со скоростью сканирования 31 Гц. Для каждого микроскопа отношение сигнал/шум оценивали по стандартному отклонению изменений флуоресценции 10 выбранных клеток.

Размеры 3D областей выбора: от точек к линиям, формам и объемам

Трехмерное сканирование точек произвольного доступа с использованием акустооптической (АО) технологии является основой гибкости Atlas, делая возможными экспериментальные стратегии, которые до сих пор были недоступны из-за ограничений обычных 2D-микроскопов (рис. 3). В режиме сканирования точки произвольного доступа Atlas может перемещаться по ряду субмикронных точек, требуя лишь очень короткого времени (30 мкс) для перемещения точки фокуса в следующую точку, что позволяет собирать данные в миллион раз быстрее в 3D, чем традиционные методы плоскостного сканирования. Микроскоп Atlas теперь реализует режимы «сканирования дрейфа», которые восстанавливают это короткое время во время прыжков, чтобы расширить точки в 3D-линии. Выровненные линии могут формировать 3D-шаблоны сканирования поверхности или объема произвольной формы, в зависимости от структуры целевых объектов, подлежащих сканированию. Режимы сканирования на основе дрейфа обеспечивают высокоэффективные и гибкие возможности для ваших экспериментальных нужд. Использование режимов 3D-сканирования на основе дрейфа позволяет вести непрерывную запись вдоль сложных структур с возможностью устранения артефактов движения, часто ухудшающих качество сигнала в экспериментах in vivo (технология 3D-антидвижения).