Фильтры для флуоресцентной микроскопии

Флуорофоры

Флуорофор - это молекула или часть молекулы, которая способна генерировать флуоресценцию. При воздействии света соответствующей частоты, необходимой для возбуждения молекулы из ее основного состояния в возбужденное состояние, происходит переход. Однако, находясь в возбужденном состоянии, молекула будет нестабильной. Через некоторое короткое время (обычно от 10^-15 до 10^-9 с) фотон высвобождается, что позволяет молекуле вернуться в состояние с более низкой энергией. Излучаемый свет будет иметь большую длину волны (более низкую энергию), чем поглощенное излучение, из-за потери энергии через различные механизмы, такие как вибрации, звук и тепловая энергия.

Один флуорофор может непрерывно возбуждаться, если он не разрушится фотообесцвечиванием (то есть необратимым разрушением флуорофора из-за вызванного фотоном химического повреждения или ковалентной модификации). Среднее число циклов возбуждения и эмиссии, которые конкретный флуорофор может пройти перед фотообесцвечиванием, зависит от его молекулярной структуры и среды; некоторые флуорофоры быстро обесцвечиваются, испуская лишь несколько фотонов, в то время как другие гораздо более устойчивы и могут пройти тысячи или даже миллионы циклов, прежде чем произойдет разрушение.

Фильтры для флуоресцентной микроскопии

Экспериментальная установка на рисунке показывает типичные фильтры, используемые для эпифлуоресцентной микроскопии, типа микроскопии, в которой как возбуждающий, так и свет от образца проходят через объектив микроскопа. Тщательно выбирая подходящие фильтры и зеркала для конкретного применения, можно максимально увеличить отношение сигнал / шум. Как показано на схеме, три типа фильтров используются для максимизации сигнала флуоресценции при минимизации нежелательного излучения. Особенности каждого оптического элемента обсуждается ниже.

Схема оптический путей флуоресцентного микроскопа

Фильтры возбуждения

Фильтр возбуждения пропускает только узкую полосу длин волн вокруг пиковой длины волны возбуждения флуорофора. Например, как показано на графике, полоса пропускания, соответствующая пропусканию более 90% для фильтра возбуждения желтого флуоресцентного белка (YFP) (MF497-16), составляет 489 - 505 нм; Падающее излучение за пределами этого диапазона либо частично (для областей вблизи области пропускания), либо полностью (для областей, расположенных дальше от полосы пропускания), блокируется фильтром.

Графики коэффициента пропускания набора фильтров MDF-YFP. Обратите внимание, что дихроичное зеркало (зеленый) отражает свет в диапазоне длин волн возбуждения (синий) и пропускает свет в диапазоне длин волн излучения (зеленый).

Дихроичный фильтр

Дихроичные зеркала предназначены для отражения света, длина волны которого ниже определенного значения (то есть длины волны отсечки), в то же время позволяя всем другим длинам волн проходить через него без изменений. В микроскопе дихроичное зеркало направляет нужный диапазон длин волн на образец, а также на систему формирования изображения. Значение длины волны отсечки, связанное с каждым зеркалом, определяется как длина волны, которая соответствует 50% пропускания. Например, как показано на графике, длина волны отсечки для дихроичного зеркала желтого флуоресцентного белка (YFP) (MD515) составляет ~ 515 нм.

Поместив одно из этих зеркал в экспериментальную установку под углом 45° относительно падающего излучения, возбуждающее излучение (показано синим на приведенном выше схематическом рисунке) отражается от поверхности дихроичного зеркала и направляется к образцу и объективу микроскопы, в то время как флуоресценция, исходящая от образца (показано красным на приведенной выше схеме), проходит через зеркало на систему детектирования.

Хотя дихроичные зеркала играют решающую роль в флуоресцентной микроскопии, они не идеальны, когда речь идет о блокировке нежелательного света; как правило, ~ 90% света на длинах волн ниже значения длины волны отсечки отражаются, и ~ 90% света на длинах волн выше этого значения передаются дихроичным зеркалом. Следовательно, часть возбуждающего света может проходить через дихроичное зеркало вместе с более длинноволновой флуоресценцией, испускаемой образцом. Чтобы предотвратить попадание этого нежелательного света в систему детектирования, в дополнение к дихроичному зеркалу используется запирающий фильтр.

Запирающий фильтр

Запирающий фильтр необходим для обеспечения того, чтобы флуоресценция от образца достигала детектора, а излучение возбуждения было заблокировано. Подобно фильтру возбуждения, этот фильтр пропускает только узкую полосу длин волн вокруг пиковой длины волны излучения флуорофора. Например, как показано на графике, полоса пропускания, соответствующая пропусканию более 90% для запирающего фильтра желтого флуоресцентного белка (YFP) (MF535-22), составляет 524 - 546 нм; Падающее излучение за пределами этого диапазона либо частично (для областей вблизи области пропускания), либо полностью (для областей, расположенных дальше от полосы пропускания), блокируется фильтром.