Оптогенетика открывает возможность активировать или подавлять отдельные популяции нейронов. С помощью этого метода исследователи смогли исследовать причинно-следственную связь между нервной активностью, функцией и поведением. Популярность оптогенетики очевидна из-за всплеска публикаций, посвященных этой методике с момента ее изобретения в 2005 году (Boyden et al. 2005).
Лаборатории, которые только знакомятся с этой технологией, вероятно, задаются вопросом, какое оборудование им нужно для выполнения метода оптогенетики.
Биологические компоненты
Первым шагом к успешному выполнению оптогенетики является овладение биологическими компонентами. Они включают выбор подходящего оптогенетического зонда, введение оптогенетического зонда в область мозга и клетки, которые обладают наибольшим интересом и имплантацию оптической канюли, если вы проводите эксперименты со свободно двигающимися животными.
Экспрессия
Решающим первым шагом для оптогенетических экспериментов является выбор подходящего оптогенетического зонда для использования.
Вы хотите активировать или ингибировать интересующую вас популяцию нейронов? Как быстро вы хотите стимулировать эту популяцию? Нужно ли использовать определенную длину волны для оптогенетической стимуляции (например, в сочетании с визуализацией)? Вот некоторые из вопросов, которые помогут вам выбрать подходящий оптогенетический зонд для ваших экспериментов (отличное руководство есть у Addgene, обобщающее доступные в настоящее время оптогенетические зонды).
После того, как вы выбрали оптогенетический зонд, он должен быть экспрессирован в мозг. Нейробиологи используют два метода для экспрессии конструктов в мозге: вирусную экспрессию и трансгенные модели мышей. Вирусная экспрессия включает инъекцию вируса, кодирующего опсин в головном мозге (Mei & Zhang 2012). Этот вирус связан с геном, представляющим интерес для целевой экспрессии в определенном типе клеток (Mei & Zhang 2012).
Нейробиологи используют вирусную экспрессию, чтобы регулировать экспрессию опсина или ограничивать ее определенной областью мозга. Это полезно, потому что экспрессия может варьироваться в зависимости от области мозга, типа клеток или вируса. Кроме того, нейробиологи могут использовать вирусную экспрессию для экспрессии опсина в проекциях мозга для отображения нейронных цепей в различных областях мозга (Mei & Zhang 2012).
По сравнению с вирусными инъекциями, трансгенные модели мышей предназначены для экспрессии опсина во всем мозге (Mei & Zhang 2012). В зависимости от трансгенной модели экспрессия опсина может варьироваться от зоны к зоне, так что одна область может экспрессировать опсин больше, чем другая. Трансгенные модели мышей могут быть использованы для получения более стабильно воспроизводимых линий для оптогенетической экспрессии в специфических клеточных типах. Или же нейробиологи, исследующие большие области коры головного мозга, используют эти модели, поскольку им требуют широкая зона экспрессии, а не экспрессия отдельной области.
Оптогенетические зонды могут быть экспрессированы через вирусную экспрессию (слева), что ограничит экспрессию определенным типом клеток и локализует ее в определенной области мозга. Для сравнения, трансгенная экспрессия (справа) широко распространяется по всему мозгу.
Имплантация канюли (свободное движение животного)
Для свободно-поведенческих оптогенетических экспериментов свет должен передаваться в мозг во время движения животного. Это достигается путем хирургической имплантации оптической канюли в область мозга, экспрессирующую оптогенетический зонд. Важным шагом в выборе оптической канюли является выбор подходящей длины для доступа к интересуемой области мозга.
После имплантации источник света подключается через волоконно-оптический кабель, и, область под канюлей будет освещена. Распространение света и глубина проникновения будут зависеть от ткани и длины волны источника света ().
В область, в которую введен оптогенетический зонд, имплантируется оптическая канюля
Компоненты оборудования
Для оптогенетических экспериментов используются две экспериментальные установки: микроскопическая и свободно-поведенческая. Эти два различных подхода к оптогенетической стимуляции имеют различные компоненты и установки.
Оптогенетика с помощью микроскопа
Оптогенетика может быть выполнена во время микроскопических экспериментов и синхронизирована с другими методами микроскопии. Для экспериментов в области нейробиологии исследователи обычно интегрируют оптогенетику в свои установки по электрофизиологии, чаще всего на стандартном эпифлуоресцентном микроскопе, чтобы исследовать нейронную активность во время своих записей (Andrasi et al. 2017); или интегрируют оптогенетику с двухфотонными экспериментами по визуализации для исследования нейронной активности во время визуализации (Forli et al. 2018).
Для клеточной биологии исследователям требуется интегрировать оптогенетику в эксперименты по конфокальной визуализации, чтобы исследовать различные генетические колебания, например (van Haren et al. 2018).
Для этих установок микроскопии необходимы два основных компонента для интеграции оптогенетики: 1) источник света и 2) набор фильтров. Источник света используется для освещения образца и активации оптогенетического зонда, важно выбрать подходящий источник света для вашего оптогенетического зонда.
Для большинства установок микроскопии коллимированный источник света будет подключен к заднему порту эпифлуоресценции для освещения образца. В зависимости от источника света, он будет соединен через прямое соединение с обратным портом или соединен через световод или волокно с эпифлуоресцентным портом. Свет будет проходить через эпифлуоресцентный порт к револьверной головке фильтра, где он будет направлен через объектив на образец. И поле обзора, и мощность источника света для оптогенетической стимуляции зависят от объектива (т. е. меньшее увеличение приводит к большему полю обзора, но также и к меньшей интенсивности света).
Как уже упоминалось выше, свет будет направлен на револьверную головку фильтра до того, как он отразится на образце. Таким образом, крайне важно выбрать подходящий набор фильтров, чтобы направить правильную длину волны на образец и потенциально блокировать ее попадание в камеру в зависимости от вашего эксперимента.
Другой метод соединения источника света для экспериментов по оптогенетике заключается освещении образца с внешней стороны независимо от микроскопа. Для этого конкретного применения может быть использован источник света с волоконной связью или прожекторный источник света. Этот метод может быть использован потому, что порт эпи-флуоресценции уже занят или вы хотите нацелиться на определенную область вашего образца.
Особенно важна точная синхронизация оптогенетической стимуляции с электрофизиологическим или визуализирующим оборудованием. Возможность синхронизации и управления источником света с помощью аналоговых или TTL-сигналов имеет решающее значение для правильной синхронизации. Например, если требуется осветить образец в течение определенного периода времени во время электрофизиологической записи.
Пример установки для оптогенетики на базе микроскопа
Свободно-поведенческая оптогенетика
Оптогенетика предоставляет причинно-следственный метод для проверки связи между нейронными цепями и поведением. Таким образом, у исследователей возникает необходимость выполнить этот метод на свободно двигающемся животном, что требует иной установки по сравнению с экспериментами на базе микроскопа.
Существуют три основных компонента для экспериментов со свободным поведением: 1) оптическая канюля, 2) волоконно-оптический кабель и 3) источник света.
Как уже упоминалось ранее, оптическая канюля имплантируется в нужную область и вводится оптогенетический зонд для освещения мозга. Как правило, оптическое волокно соединено с оптической канюлей и подключено к волоконно-связанному источнику света. Это позволяет свету перемещаться от источника света к мозгу свободно двигающегося животного. Гибкое оптическое волокно позволяет животному свободно перемещаться и освещает мозг для оптогенетической стимуляции.
В зависимости от сложности поведения животного, исследователи могут использовать коммутатор, который предотвращает скручивание волокна и ограничивает движения животного.
Подобно экспериментам оптогенетики с микроскопом, исследователям может потребоваться синхронизировать оптогенетическую стимуляцию с определенными поведенческими событиями или оборудованием. Например, если животное перемещается в определенную область, может потребоваться ее освещение в течение определенного периода времени. Это возможно благодаря синхронизации с TTL или аналоговыми сигналами.
Пример установки для свободно-поведенческой оптогенетики
