Cистемы для оптогенетики клеточного разрешения

Способность освещать отдельные нейроны в популяции оптогенетически экспрессирующих нейронов называется оптогенетикой клеточного разрешения (Shemesh et al. 2017). Используя этот метод, исследователи требуют более сложной пространственной спецификации для селективной стимуляции отдельных нейронов в оптогенетически экспрессирующей популяции.

Развитие пространственно ориентированных световых технологий позволило исследователям контролировать, где свет освещает образец, например, отдельную клетку, что сделало возможной оптогенетику клеточного разрешения (Ronzitti et al. 2017).

Какие системы доступны для оптогенетики клеточного разрешения?

Гальво-сканирование

Простейшая форма структурированного освещения осуществляется с помощью метода последовательного сканирования. Сфокусированный луч света направляется в определенную область образца с помощью пары гальванометрических зеркал.

Этот метод "сканирования на основе гальво" обычно использует мощный лазерный луч (либо перестраиваемый, либо с фиксированной длиной волны) для стимуляции опсинов. Освещение ограничено одним пятном за один раз, и интенсивность пятна имеет гауссовское распределение. Паттерны, более сложные, чем одно пятно, создаются на образце путем последовательного освещения различных точек, обычно растровым или спиральным сканированием, в зависимости от условий эксперимента.

Поскольку паттерны генерируются последовательным сканированием, временная точность системы в первую очередь ограничена приводами позиционирования зеркал гальванометра. Обычным сканирующим системам на основе гальво требуется около 100 мкс, чтобы перенаправить луч на новый ROI.

Следовательно, генерация паттерна путем сканирования через полное поле зрения может занять значительное количество времени. Такие ограничения временной точности в этой системе представляют проблему для стимуляции и регистрации быстрых физиологических событий, таких как генерация потенциалов действия, которые срабатывают на порядке сотен Гц.

Улучшения временной точности сканирующих систем на основе гальво были сделаны с использованием резонансных сканирующих зеркал (Wang et al. 2007; Packer et al. 2012), или акустооптические дефлекторы (AOD), которые могут обеспечить доступ сканирования к любой отдельной точке в поле обзора в течение микросекунд (Zhu et al. 2009). Однако минимальное время пребывания, необходимое для достаточного освещения, чтобы вызвать физиологическую реакцию – внутреннее свойство молекул опсина -ограничивает степень до которой скорость сканирования может быть увеличена.

Установка гальво-сканирования

Сканирование на основе гальво подходит для одно -, или двухфотонных систем. Однофотонная фотостимуляция может обеспечить пространственное разрешение в десятки микрон в поперечном измерении, достаточное для возбуждения небольших групп соседних нейронов. Однофотонные сканирующие системы на основе гальво в основном используются в картографических исследованиях, где свет направляется на небольшую популяцию меченых нейронов и измеряется активность на нижестоящих мишенях (Petreanu et al. 2009; Wang et al. 2007).

В двухфотонных системах может быть достигнута достаточно высокая пространственная точность для стимуляции отдельных клеток или даже отдельных дендритных шипов (Zhu et al. 2009; Packer et al. 2012). Применение этой стратегии освещения может быть ограничено по двум причинам. Во-первых, не все опсины легко активируются с помощью двухфотонного возбуждения. Во-вторых, точное пространственное разрешение, обеспечиваемое двухфотонным возбуждением с помощью гальваносканирования, может быть применено только к одному нейрону одновременно. Эта установка используется в исследованиях, отображающих анатомические особенности типов клеток и проекций (Rickgauer & Tank 2009; Prakash et al. 2012).

Ключевым ограничением в системах гальво-сканирования является то, что в определенный момент времени может быть освещено только одно небольшое пятно. Эта неспособность освещать одновременно несколько интересующих областей существенно ограничивает возможности применения системы, поскольку она не может помочь в вопросах, исследующих как несколько нейронов ведут себя одновременно. Приблизительное одновременное измерение нейронной активности может быть сделано, когда два соседних нейрона стимулируются в быстрой последовательности, благодаря кинетики опсинов, имеющих длительное время действия (Lin et al. 2009). Однако число нейронов, которые могут быть «одновременно» активированы таким образом, весьма ограничено.

Гальво-сканирование особенно выгодно тем, что существует минимальная потеря интенсивности света вдоль оптического пути. Таким образом, сфокусированный луч обеспечивает хорошую интенсивность освещения образца, позволяя использовать одну и ту же систему как для доставки света, так и для визуализации. Кроме того, освещение достаточно равномерное и не подвержено фоновым помехам от других источников света.

Освещение паттерна с использованием гальво-сканирующей системы, как правило, удобна в использовании и легко интегрируется с существующими системами, а также может использоваться как для экспериментов in vitro, так и для экспериментов in vivo с фиксацией головы.

В то время как сами гальванометрические зеркала не особенно дороги, требование к мощным лазерам, представляет существенную стоимость, так же, как и программное обеспечение для управления гальво, это означает, что полностью собранная система может быть дорогостоящей.

Поскольку гальво-сканирующие системы обеспечивают высокую интенсивность освещения в одной точке, они лучше всего подходят для исследований, требующих высокой степени освещения на небольшой площади, как при фотолизе нейромедиаторов и в исследованиях оптогенетического картирования.

Голографическая проекция

Для решения проблем, возникающих при последовательном освещении, может быть использовано параллельное возбуждение, как в фазо - и амплитудно-пространственной модуляции света. Методы параллельного возбуждения более приспособлены к различным экспериментальным потребностям, поскольку они позволяют одновременно освещать несколько дифракционно-ограниченных пятен на образце.

Фазовая модуляция обычно использует преимущества компьютерных голограмм (CGHs) для стимуляции нескольких точек одновременно. Желаемый паттерн освещения проектируется на компьютере, после чего проекция для освещения генерируется численным алгоритмом, который вычисляет соответствующую фазовую голограмму. Затем эта голограмма проецируется на пространственный модулятор света (SLM). Опорный луч отражается на SLM и через набор оптики визуализации, чтобы доставить восстановленный паттерн освещения на образец.

Голографические системы обладают тем преимуществом, что могут одновременно стимулировать любое количество и форму трехмерного паттерна на образце. Еще одно преимущество перед гальво-сканированием - голографическая система обеспечивает гораздо большее временное разрешение, чем может быть достигнуто последовательными методами сканирования. При использовании предварительно вычисленных моделей голографических проекций можете переключиться между множеством дискретных моделей со скоростью 60-200 Гц в стандартном жидком кристалле на кремнии (LCoS) SLM систем, и до кГц в ферроэлектрических системах высокого класса LC- SLM (Reutsky-Gefen et al. 2013; Papagiakoumou 2013).

Голографическим системам потребуется до нескольких минут, чтобы вычислить и генерировать новые паттерны. Это означает, что для приложений, требующих быстрого или в режиме реального времени формирования паттернов, голографический метод будет не самым подходящим. Поскольку вычисление нового голографического паттерна может занять несколько минут, этот метод не подходит для приложений, требующих генерации, загрузки и активации паттерна в режиме реального времени.

Голографическая проекционная установка

Как одно-, так и двухфотонные системы могут быть использованы с голографическим паттерном освещения. С помощью однофотонной микроскопии можно одновременно стимулировать от сотен до тысяч нейронов. Этот метод широко используется для устранения последствий активации клеточных типов с конкретными пространственными структурами (Reutsky-Gefen et al. 2013; Nikolenko et al. 2010).

Повышение пространственной точности может быть достигнуто с помощью двухфотонной голографической стимуляции, достигающей пространственного разрешения порядка нанометров (Papagiokoumou et al. 2010), позволяющая одновременно активировать несколько одиночных дискретных нейронов (Packer et al. 2012). Однако это увеличение пространственного разрешения происходит за счет временной когерентности лазерного луча, поскольку два фотона с меньшей вероятностью будут находиться в фазе. Следовательно, контраст между освещенными зонами и фоном будет уменьшен.

Для исследований, изучающих эффекты манипулирования нейронным кодом одиночных нейронов, особенно хорошо подходит двухфотонное голографическое освещение паттерном (Packer et al. 2012). Голографическая система может быть использована как in vitro, так и для экспериментов in vivo с фиксацией головы животного.

Хотя эта система теоретически обеспечивает хорошую интенсивность освещения, на практике существуют некоторые проблемы эффективности. Зоны освещения неоднородны, характеризуются ярким фокусом с непрерывно уменьшающейся интенсивностью по направлению к краям (Lutz et al. 2009). Это приводит к плохому контрасту между точками освещения и фоном, а, следовательно, и к плохо выраженным краям освещения.

Голографические системы также чувствительны к фоновому шуму, который может вызвать спекл-структуры и интерференцию, что приводит к нежелательным точкам освещения на образце. Это может быть особенно проблематично, если нежелательное освещение будет стимулировать нейроны, которые будут мешать данному эксперименту.

Голографическая система является наиболее дорогостоящей и наиболее трудной для интеграции с существующими системами. Голографические системы требуют изрядного опыта для правильного использования и могут быть очень дорогими, в значительной степени из-за высокой стоимости составных частей (лазеры и SLM, а также компьютерное оборудование и программное обеспечение). Существуют также проблемы с отсутствием надежной точности и повторяемости паттерна освещения для системы, в частности из-за непреднамеренного возникновения спекл-структур. Поэтому голографические системы требуют значительного уровня знаний для того, чтобы создать рабочую систему для экспериментального использования.

Еще одним недостатком голографической проекции является то, что она может работать только с одной определенной оптической длиной волны в определенное время, так как каждый голографический паттерн должен быть рассчитан на определенную длину волны. Это означает, что голографическая проекция может плохо работать для приложений, требующих нескольких длин волн.

DMD осветитель

Третье, это системы структурированного освещения. Они широко используются в экспериментах оптогенетики, включают цифровое микрозеркальное устройство (DMD), например,  осветитель Polygon от Mightex. DMD - это массив из множества микроскопических зеркал, каждое из которых может управляться независимо.

При освещении, каждое микрозеркало соответствует пикселю в схеме освещения, определенной пользователем, и им можно индивидуально и независимо управлять для отражения света на образец; зеркала поворачиваются примерно на 12 градусов либо в включенное, либо в выключенное состояние (Knapcsyk & Krishnan 2005). При повороте в положение «вкл» микрозеркало направляет свет в оптический тракт микроскопа для освещения образца. При повороте в положение «выкл» свет направляется в сторону от оптического пути, что приводит к появлению темного пикселя в соответствующей точке образца.

Как и в случае с голографической проекцией рисунка, DMD-системы способны стимулировать несколько дискретных ROI одновременно, позволяя параллельно возбуждать несколько ячеек при сохранении высокой контрастности относительно фона. Поскольку матрица микрозеркал действует так, чтобы отражать отдельные пиксели света на образец, размер пятна освещения на образце ограничен только объективом и количеством микрозеркалов на чипе DMD.

С большими массивами микрозеркал и высоким увеличением линзы объектива(≥40X), один пиксель может осветить область размером 0,4 мкм х 0,4 мкм на образце, достаточно малую, чтобы стимулировать отдельные части клетки.

Установка c DMD источником

Преимущество пикселизации с высоким контрастом заключается в том, что освещение будет хорошо локализовано в области паттерна. Острый край освещения помогает гарантировать, что свет направлен только в нужную область и не захватывает нежелательные области. Это может помочь обеспечить больший контроль над экспериментом возбуждения.

Ключевым преимуществом системы является временная точность, при частоте обновления 1-10 кГц DMD-системы могут быть достаточно быстрыми для стимуляции в физиологически реалистичной временной шкале (Wilt et al. 2009). Генерация паттернов в режиме реального времени также может быть достигнута, и это особенно полезно в экспериментах с замкнутым контуром, где отслеживается движущаяся цель и должн быть сгенерирован и доставлен к цели точный паттерн освещения.

В отличие от гальво-сканера или голографического проектора, с DMD-осветителем практически любой источник света (например, лазеры, светодиоды, ксеноновые, металло-галогеновые лампы и т. д.) может быть использован для освещения образца, что делает его наиболее универсальной системой, которая облегчает пользователям выбор практически любой длины волны для их применения. С развитием сверхвысоких светодиодов и других мощных источников освещения, например, осветитель DMD может обеспечить освещение паттерна на любой длине волны с достаточной интенсивностью освещения для активации различных опсинов.

Ключевым преимуществом систем на основе DMD является высокая степень равномерности освещения по всему образцу, что означает не только сохранение равномерности по заданной области освещения, но и то, что интенсивность постоянна по дискретным областям освещения, независимо от положения в поле обзора. Кроме того, существует очень мало фоновых шумов (коэффициент контрастности 1000:1), вызывающих помехи в освещении, и никаких нежелательных паттернов освещения не генерируется, как в случае с системами гальваносканирования.

Как правило, DMD-системы наиболее полезны при изучении влияния активации типов клеток в определенных паттернах (Blumhagen et al. 2011; Munch et al. 2009). DMD широко использовались в экспериментах in vitro, а также в оптогенетических экспериментах in vivo с использованием таких организмов, как свободноживущая нематода (Leifer et al. 2011), данио-рерио (Zhu et al. 2012), а также мышей, в случае которых возможен оптический доступ к свободно двигающемуся животному.

Из трех систем, рассмотренных в этой статье, DMD система предлагает наибольшую простоту использования при наименьших затратах. Она легко интегрируется с существующими коммерческими микроскопами и очень легко адаптируется.

Таблица сравнения систем