Арт. ct-dSPIM
Флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения
Современный мир световой микроскопии в области биологических исследований предъявляет высокие требования к исследовательским приборам, а постоянно развивающиеся приложения требуют оборудования, способного идти в ногу. Биологическая визуализация в течение многих лет последовательно движется к экспериментам с использованием систем, которые могут все точнее показывать физиологию, и новые технологии делают такие экспериментальные подходы осуществимыми. Такие системы, включая целые организмы, экспланты тканей и трехмерные (3D) клеточные культуры, должны, помимо прочего, быть отображены таким образом, чтобы искажения в изображении были минимальные, а физиологическая целостность экспериментальных моделей сохранена. Фотоповреждения, вызванные действием света, и фототоксичность долгое время являлись проблемой в области биологической визуализации, так как они могут оказывать весьма существенное влияние на здоровье организмов, а также функционирование на всех биологических уровнях организации живых образцов. Таким образом, получение изображений крупных и чувствительных образцов требует эффективного подхода к получению трехмерного изображения, который бы позволил минимизировать время экспозиции.
Рис. 1 Способы освещения и детектирования
Сравнение геометрии освещения и детектирования флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения с эпифлуоресценцией. (a) Геометрия флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения: объектив с малой числовой апертурой, проецирует световой «лист» на образец. Флуоресценция детектируется с помощью объектива с большой числовой апертурой, ориентированного ортогонально первому объективу и проецируемому световому «листу». (б) Типичная эпископическая геометрия освещения и детектирования, где возбуждение и детектирование выполняются с использованием общего объектива и общего пути распространения света.
Флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения — это общее название для постоянно растущего семейства методов плоскостного освещения, которые произвели революцию в том, как может быть выполнена оптическая визуализация биологических образцов. По сути, методы флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения становятся возможными благодаря разделению оптических путей освещения и детектирования, что позволяет применять новые стратегии освещения, которые оптимизируют эффективность сбора фотонов в приборе. Эта общая концепция иллюстрируется рисунком 1 выше. Световой «лист» формируется с помощью лазерного излучения, либо в форму гиперболического «листа», либо аппроксимируется путем сканирования слабо сфокусированного луча с малой апертурой в поперечных направлениях, как в традиционных лазерных сканирующих микроскопах. Важно отметить, что детектирование выполняется вдоль оси, отличной от оси освещения, чаще всего в ортогональном направлении, чтобы максимально увеличить эффективность детектирования путем минимизации флуоресценции от элементов вне фокуса.
При стандартных эпископических подходах (то есть конфокальных и широкополосных) конус освещения и детектирования растягивается в осевом направлении (z), возбуждая сильный флуоресцентный сигнал от областей, находящихся вне фокуса и ухудшая качество сигнала от областей образца, находящихся в фокусе, как показано на рисунке 2 ниже. С помощью флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения можно использовать более низкие интенсивности освещения в сочетании с плоским (или иным образом структурированным) освещением для обеспечения улучшенного отношения сигнал/шум с минимальной экспозицией образца, что позволяет получать изображения с высокой частотой кадров и в течение длительных периодов времени. Сканирование светового «листа» или образца в осевом направлении позволяет получать 3D-изображения быстро и нанося минимальный вред образцам.
Рис. 2 Световая экспозиция в флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения и при эпи-флуоресценции
Сравнение светового «листа» и традиционного эпископического освещения. (а) Иллюстрация плоского освещения, обеспеченного парой осветительных объективов. (б) Типичное широкополосное освещение с большой долей освещения за пределами глубины резкости объектива. (c) Облучается только тонкий участок образца, который затем обесвечивается с помощью плоского освещения. (d) Эпи-освещение приводит к облучению гораздо большего объема образца, большая часть которого не в фокусе, а также к ухудшению сигнала в фокусе. Флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения может значительно уменьшить фотообесцвечивание и другие фототоксические эффекты через осевое ограничение освещения.
Осевое ограничение освещения приводит к значительному снижению фотообесцвечивания и фототоксичности, что позволяет осуществлять долгосрочную визуализацию в течение многих дней или даже недель. Тем не менее, флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения может быть трудной в реализации, обычно требующей двух или более объективов, нестандартных протоколов подготовки образцов, сложных процедур выравнивания лучей света и хорошо спланированного рабочего процесса для обработки огромных объемов данных, полученными такими методами (часто в терабайтах). Области, которые существенно выигрывают благодаря использованию флуоресцентной микроскопии плоскостного излучения, включают биологию развития / эмбриологию, нейробиологию, исследование лекарств, биологию растений и многое другое. В этой статье будут рассмотрены основы флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения (включая краткую историю), рассмотрены различные варианты ее реализации и применения, а также рассмотрены основные аспекты подготовки образца.
Историческая справка
В основе флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения лежит методика, называемая «ультрамикроскопия», впервые предложенная в 1902 году Рихардом Адольфом Зигмонди, химиком-органиком и физиком-экспериментатором, и Генри Зидентопфом, физиком-оптиком. Первоначальный ультрамикроскоп сфокусировал солнечный свет для бокового освещения растворов коллоидного золота для получения картины рассеяния, детектируемой ортогонально к плоскости освещения. Этот подход значительно увеличил отношение сигнал/шум по сравнению с существующими методами, делая возможным наблюдение отдельных молекул золота. Французский ученый Жан Перрен продолжил работу Зигмонди, применив ультрамикроскопию для составления графика движения частиц, предоставляя бесценные доказательства броуновского движения. Позже Зигмонди был удостоен Нобелевской премии по химии за работу с ультрамикроскопией и коллоидными растворами. Изображение первоначального ультрамикроскопа Зигмонди приведена на рисунке 3. В течение многих лет этот метод был в значительной степени забыт, поскольку в 1960-х годах плоскостное освещение стало не так широко использоваться в области фотомакрографии, которая получила популярность благодаря микроскопу «Dynaphot».
Рис. 3 Система Ричарда Зигмонди
Изображение ультрамикроскопа Ричарда Зигмонди. Осветитель находится справа, а микроскоп - слева, с ортогонально установленным объективом для передачи освещения.
Первая комбинация плоскостного освещения с флуоресцентной микроскопией появилась в 1993 году, когда Арне Вои и Дэвид Бернс из лаборатории Фрэнсиса Спелмана в Вашингтонском университете впервые применили флуоресцентную микроскопию с оптическими сечениями в ортогональной плоскости (OPFOS) для визуализации и создания карты улитки внутреннего уха морской свинки. Одной из проблем, с которой столкнулся Вои, была непрозрачность богатой кальцием кости. Атомы кальция сильно рассеивают свет, делая оптическую визуализацию через кость практически невозможной, однако они могут быть удалены с помощью 10% раствора ЭДТА в воде. Затем их группа использовала раствор, по столетней рецептуре, известный как раствор Шпальтегольца, состоящий из смеси масел для аппроксимации показателя преломления белка.
Изображения, полученные Вои и его коллегами были сравнимы по качеству с изображениями, полученными с помощью высокочувствительных томографических методов, таких как рентгеновская микрокомпьютерная томография (мкКТ), но с превосходной способностью распознавать структуры мягких тканей. Это важно, так как Вои и его коллеги пытались соотнести морфологию волосковых клеток с потерей слуха, поэтому у них была необходимость получить изображение ткани с высокой точностью. Соответствующие рентгеновская микрокомпьютерная томография и флуоресцентная микроскопия с оптическими сечениями в ортогональной плоскости будут реализованы позже. Обратите внимание, что в этой и последующих работах группы Спелмана флуоресцентная микроскопия с оптическими сечениями в ортогональной плоскости будет рассматриваться как томографический метод, но не обязательно для разрешения субклеточных структур, поскольку они продемонстрировали продольное разрешение 10 мкм и осевое разрешение 26 мкм с очень широким полем зрения 1,5 мм х 1,5 мм. Однако, несмотря на успех флуоресцентной микроскопии с оптическими сечениями в ортогональной плоскости, флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения останется относительно неясной техникой в течение нескольких лет.
В 1994 году Эрнст Х. К. Стелцер и Стеффен Линдек из Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) опубликовали статью, описывающую новую методику: конфокальную тета-микроскопию. Этот метод использует оптику для освещения и детектирования, расположенную ортогонально друг другу, подобную современным системам флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения, но как часть конфокального микроскопа с точечным сканированием. Функции рассеивания точек освещения и детектирования перекрываются только в их общем фокусе, что приводит к увеличению осевого разрешения в 3-4 раза по сравнению с обычными методами конфокальной визуализации.
В 2002 году флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения приобрела новый интерес, когда Эран Фукс и его коллеги применили тонкослойную флуоресцентную микроскопию на световых «листах» для визуализации невозмущенной водной микроокружающей среды, особенно образцов морской воды. Несмотря на то, что определение «тонкий» использовался для светового «листа», размеры аналогичны тем, которые первоначально использовались для флуоресцентной микроскопии с оптическими сечениями в ортогональной плоскости, толщина перетяжки луча 23 мкм и поле зрения 1 х 1 мм. Одна из причин, почему их группа выбрала тонкослойную флуоресцентную микроскопию плоскостного освещения, это возможность обнаружить бактерию c помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I без последующей фильтрации бактерии из образца морской воды для удаления свободного красителя. Тонкослойная флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения показала достаточно хорошую чувствительность для того, чтобы изобразить помеченную бактерию с минимальным фоном от красителя в растворе. Хотя конфокальная микроскопия могла обеспечить оптическое секционирование и уменьшить фон, тонкослойная флуоресцентная микроскопия на световых «листах» делает это с превосходной скоростью и со значительно лучшим отношением сигнал/шум, что важно для захвата динамики движения быстродвижущихся микробов.
Наконец, в 2004 году группа Штельцера представила разновидность конфокальной техники с использованием плоских световых «листов» и широкопольного (а не конфокального) детектирования, опубликовав свой документ, посвященный селективной микроскопии плоскостного освещения (Selective Plane Illumination Microscopy - SPIM). Хотя селективная микроскопия плоскостного освещения показала относительно незначительные технические различия по сравнению с ее предшественниками, настоящим прорывом стало ее применение в визуализации живых трансгенных GFP-экспрессирующих организмов, включая GFP-меченую мышцу в естественно-прозрачной рыбе Medaka Oryzias latipes и эмбриогенез обыкновенной плодовой мухи Drosophila melanogaster с использованием GFP-моэсина (маркер плазматической мембраны). Это одно из самых популярных приложений флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения для флуоресцентной визуализации эмбриогенеза на сегодняшний день. Введение селективной микроскопии плоскостного освещения ознаменовало очень важный шаг в развитии флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения, спустя годы после ее открытия, она пройдет через взрыв новых методов и улучшений, которые мы рассмотрим подробно.
Световые "листы"
Свойства световых «листов»
Возможно, наиболее важным компонентом любой флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения является сам световой «лист», который может принимать форму статического плоского «листа», как это было изначально в селективной микроскопии плоскостного освещения, или сканирующий луч, аппроксимирующий световой «лист» с течением времени. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, но важно понимать некоторые фундаментальные свойства световых «листов». Рисунок 4 иллюстрирует различные типы световых «листов» и важные параметры, обсуждаемые здесь.
Во-первых, невозможно создать идеально плоский световой «лист», его можно только аппроксимировать и только в заданном диапазоне. Осевое разрешение в конечном итоге ограничено толщиной светового «листа» и числовой апертурой детектирующего объектива. Как статические плоские, так и световые «листы», получаемые путем сканирования, имеют гиперболический профиль в плоскости xz (рис. 4), при этом перетяжка луча (w0) задает толщину наиболее плотно сфокусированной средней точки профиля освещения и рассчитывается по следующему уравнению:
Где w0 - толщина перетяжки луча, f - фокусное расстояние осветительной оптики, λ – используемая для освещения длина волны, а Dlens – диаметр диафрагмы осветительной оптики. Особую озабоченность вызывает конфокальный параметр (b) светового «листа», который определяет расстояние, на котором можно сказать, что лист обеспечивает почти гомогенное плоское освещение. Расстояние от центра до места, где перетяжка пучка увеличивается в корень из 2 раз в одном направлении составляет длину Рэлея (XR), которая по определению составляет половину конфокального параметра. Таким образом, конфокальный параметр определяет максимально полезную продольную протяженность светового «листа» в направлении распространения. Увеличение параметра конфокальности за счет создания большего светового «листа» напрямую приводит к увеличению перетяжки пучка (ограничение осевого разрешения), как описано в приведенном ниже уравнении, касающемся параметра конфокальности и толщины перетяжки пучка:
Где b - конфокальный параметр, XR - длина Рэлея, w0 - толщина перетяжки пучка, а λ - используемая для освещения длина волны. Например, если выбрана толщина светового листа ~ 2 микрометра, и визуализация выполняется с использованием зеленого света с длиной волны 561 нм, конфокальный параметр будет составлять приблизительно 22.4 мкм, что достаточно для визуализации отдельных клеток, но не для получения изображений более крупных образцов. Для сравнения, световой «лист» с перетяжкой пучка w0 = 10 мкм имеет конфокальный параметр b со значением более 1 мм. Следует отметить, что эти уравнения предназначены для характеристики световых «листов», распространяющихся в воздухе (показатель преломления n = 1.0), в среде с показателем преломления n, конфокальным параметром становится:
Где n - показатель преломления среды, а bn - конфокальный параметр в среде с показателем преломления n. Таким образом, можно расширять световые листы, позволяя им распространяться в материалах с более высоким показателем преломления, таких как вода (n = 1,33). Исследователи уделяют внимание специализированным подходам к расширению конфокального параметра световых «листов» без утолщения перетяжки пучка с использованием специализированных методов, которые будут обсуждаться более подробно. Нужно иметь в виду, что представленные уравнения могут использоваться для характеристики не только статических плоских световых «листов», но и «виртуальных» световых «листов», созданных сканирующим лучом.
Рис. 4 Варианты световых «листов» и основные параметры
Плоские световые «листы»
Более старые методы флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения, такие как флуоресцентная микроскопия с оптическими сечениями в ортогональной плоскости, использовали одну цилиндрическую линзу для создания и проецирования светового «листа» в образец. Как и сферические линзы, цилиндрические линзы используются для рассеивания или фокусирования света, но только вдоль одной оси. Более сложные итерации техники используют цилиндрическую линзу в сочетании с объективом для улучшения оптических свойств светового «листа».
Сканирующие световые «листы»
Одно из решений для разрыва взаимозависимости между параметром конфокальности и толщиной перетяжки пучка заключается в сканировании в боковых направлениях для получения тонкого светового «листа» и последующем сшивании участков изображения вместе для создания составного изображения большего размера, чем диктуется одним только параметром конфокальности. Этот подход использовался в флуоресцентной микроскопии с оптическими сечениями в ортогональной плоскости с высоким разрешением (HR-OPFOS) и в лазерной сканирующей микроскопии с «тонким листом» (sTSLIM), а также применялся для визуализации мозжечка мыши и улитки внутреннего уха. Недостатком этого подхода является то, что он требует бокового, а также осевого сканирования, что приводит к увеличению времени сбора данных и большей экспозиции, что частично сводит на нет одно из главных преимуществ флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения - выборочное освещение только тех объектов, которые должны быть отображены. Кроме того, при регистрации и сшивании изображений также могут возникать проблемы несмотря на то, что алгоритмы регистрации в последние годы улучшились и позволяют использовать проверочные метки для регистрации местоположения особенностей образцов.
Как правило, образец сканируется в осевом направлении с помощью светового «листа» для генерации z-серий, однако объективы могут быть смещены относительно стационарного образца. В последнее время многие исследовательские группы решили использовать стандартные лазерные гауссовские лучи, а не световой «лист», сканируя луч в боковом направлении, чтобы имитировать плоский световой «лист». Затем следует осевой сдвиг луча с использованием сканирующего f-theta объектива и соответствующих сканирующих зеркал, что позволяет получить полную серию без перемещения объектива или образца. Этот подход называется цифровой сканирующей лазерной микроскопией плоскостного освещения (DSLM) и был разработан Филиппом Келлером и его коллегами в 2008 году.
Многофотонные «световые» листы
Как плоские, так и цифровые сканирующие световые «листы» могут использоваться в сочетании с многофотонным возбуждением. Двухфотонное возбуждение (2PE) происходит, когда флуорофор поглощает два фотона одновремнно, где объединенные энергии подобны той, которая необходима для возбуждения флуорофора в возбужденное состояние с использованием одного фотона. Двухфотонное возбуждение - чрезвычайно редкий процесс в естественном мире, происходящий только при чрезвычайно высокой плотности фотонов, как это реализовано в фокусе очень мощного фемтосекундного импульсного лазера. Длина волны для двухфотонного возбуждения должна быть примерно в два раза больше, чем в типичном однофотонном случае, хотя это скорее ориентир, чем правило, все равно следует обращаться к известным двухфотонным спектрам поглощения.
Поле визуализации несколько уменьшено в размерах при многофотонном возбуждении по сравнению с обычными однофотонными подходами из-за уменьшенной области фокусировки, однако длинноволновый инфракрасный свет, используемый для двухфотонного возбуждения, лучше подходит для проникновения в образец в рассеивающих средах. В самом деле, оптическое окно прозрачности в биологии существует между 650 нм и 1200 нм, где автофлуоресценция минимальна, а поглощение гемоглобином, водой и белком низкое. Это особенно полезно для экспериментов с флуоресцентной микроскопией плоскостного освещения, так как образцы часто имеют толщину несколько миллиметров и сильнее рассеивают и/или поглощают по сравнению с тонкими образцами. Таким образом, основными преимуществами многофотонного возбуждения являются уменьшенное рассеяние/поглощение и, следовательно, более глубокое проникновение в образец. Этой техникой пользуются при работе с длинноволновым излучением в инфракрасной области спектра.
Пучки Бесселя и дискретное освещение
Лаборатория Александра Рорбаха впервые продемонстрировала использование самовосстанавливающихся бесселевых пучков для создания цифрового сканирующего светового «листа». Лучи Бесселя генерируются посредством проекции кольцевого узора на периферию заднего зрачка осветительного объектива или путем формирования освещения с помощью аксикона. В идеальном случае эти лучи можно рассматривать как недифракционные: при наличии препятствия луч Бесселя будет преобразовываться после препятствующего объекта, что можно описать как «самовосстановление».
Пучок Бесселя можно сделать намного тоньше стандартного гауссова пучка, что позволяет получать более тонкие световые «листы». Наиболее существенная проблема, связанная с освещением пучком Бесселя, заключается в том, что большая часть энергии пучка находится в боковых «лепестках», сильнее размывая границы пятна рассеяния, чем на типичной дифракционной картине Эйри. Эти боковые «лепестки» на самом деле жизненно важны для самовосстанавливающихся свойств луча, но они эффективно уменьшают размер перетяжки луча. Одним из решений этой проблемы является сочетание освещения лучом Бесселя и двухфотонного возбуждения, которое было продемонстрировано для формирования очень тонких световых «листов» (менее половины микрометра). Интенсивность освещения луча Бесселя достаточно высока, чтобы достичь двухфотонного возбуждения, эффективно устраняя возбуждение боковыми лепестками областей, находящихся вне фокуса. Используя этот подход, лаборатория Эрика Бетцига продемонстрировала изотропное разрешение 300 нм в живых клетках со скоростью визуализации около 200 изображений плоскостей в секунду. Лучи Бесселя также использовались в сочетании с методом микроскопии некогерентного структурированного освещения (SIM), позволяющим и в вычислительном отношении различать и отклонять информацию о низкой пространственной частоте, возникающую из флуоресцентных структур, находящихся не в фокусе. Преимущества микроскопии структурированного освещения и двухфотонного возбуждения в сочетании с лучами Бесселя аналогичны друг другу.
Развивая идею применения бесселевых пучков к флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения, лаборатория Betzig представила новую мощную флуоресцентную микроскопию плоскостного освещения: микроскопия светового листа с дискретным освещением. Вместо использования сканирующих бесселевых пучков этот метод использует аналогичные методы для проецирования "оптических решеток" в плоскость образца. "Оптическая решетка" — это периодическая интерференционная картина, созданная наложением двух или более плоских волн и имеющая 2D или 3D структуру. Однако, в отличие от пучков Бесселя, которые создаются путем ограничения освещения в очень тонкую область в форме кольца на плоскости заднего зрачка осветительного объектива, "оптическая решетка" создается путем освещения отдельных точек вокруг кольца. Дискретная подсветка в виде "оптической решетки" позволяет пользователю выбрать схему, оптимизированную для осевого разрешения или ограничения освещенности.
Микроскопия светового листа с дискретным освещением была продемонстрирована в нескольких различных «режимах». «Стандартный» режим включает быстрое колебание рисунка "оптической решетки" с использованием гальванометра для обеспечения равномерного по времени освещения каждого бокового участка, что приводит к отчетливым усредненным по времени схемам освещения. Режим структурированной подсветки обеспечивает пространственное разрешение примерно в 1.3-1.5 раза больше, чем в режиме с колебанием рисунка, но временное разрешение примерно в 7.5 раз хуже.
Ценность визуализации методом плоскостного освещения с дискретным освещением была продемонстрирована для экспериментов по отслеживанию одиночных молекул и визуализации с супер-разрешением. Небольшие и плотно сфокусированные световые «листы» обычно имеют перетяжку пучка около 4-5 мкм, в несколько раз толще, чем типичная глубина резкости объективов с высокой числовой апертурой. В отличие от этого, колеблющиеся "оптические решетки" имеют эффективную перетяжку луча, близкую к 1 мкм, точнее совпадающую глубиной резкости объективов с высокой числовой апертурой и превосходную для изображения одиночных молекул в высоком разрешении. Ограниченное возбуждение одиночных излучателей в фокусе объектива позволяет детектировать большую долю эмиссии одиночных молекул.
Пучки Эйри
Подобно пучкам Бесселя, пучки Эйри инвариантны к распространению и являются «самовосстанавливающимися». Лучи Эйри формируются путем модуляции типичного гауссова луча в задней апертуре объектива с использованием пространственного модулятора света, что приводит к характерной асимметричной поперечной структуре луча Эйри (рисунок 4). Интересно, что пучки Эйри проходят через толстые и рассеивающие среды даже дальше, чем пучки Бесселя. Световой «лист» Эйри формируется аналогично другим "листам" цифровой сканирующей лазерной микроскопии плоскостного освещения, путем колебания пучка вдоль оси Y, чтобы создать виртуальный «лист» освещения.
Методы визуализации в флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения
Визуализация в разных проекциях и направлениях
Одной из наиболее распространенных проблем флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения является наличие полос-артефактов. Эти искажения возникают в результате однонаправленного освещения. Элементы образца, которые рассеивают, поглощают или иным образом возмущают падающий луч на поверхности образца, приводят к ослабеванию освещения внутри образца, что приводит к появлению темных «полос». Эти полосы проиллюстрированы на рис. 5 (b, d), где гипотетический образец, содержащий оптически непрозрачные структурные элементы (оранжевые кружки), подвергается одностороннему освещению, а результирующие тени / полосы отчетливо видны на рисунке.
Рис. 5 Артефакты/тени и их коррекция с помощью визуализации нескольких проекций
Одним из первых решением проблемы теней (полос) было применение формирования изображения образца в разных проекциях, реализуемого путем последовательного вращения в плоскости xy и визуализации образца в каждой плоскости z, с последующим объединением изображений каждой проекции для создания высококачественного составного изображения. Обычно, несколько z-стеков регистрируют последовательно, каждый стек для одной проекции. Например, после получения первой серии изображений по z, образец поворачивается на заранее определенный угол для получения второй серии изображений и так далее до тех пор, пока не будет получено необходимое количество изображений, обычно 4-6. После получения окончательного z-стека для каждой проекции составные оптические срезы создаются с использованием специализированных алгоритмов слияния и деконволюции для объединения изображений, создавая в результате изображение высокого разрешения с низкими отклонениями качества по всему объему образца. Преимущества такого изображения более подробно рассматриваются на рисунке 5.
Составное изображение позволяет имитировать однородное освещение каждой плоскости z. Хотя все участки образца освещены не полностью равномерно, особенно при небольшом количестве проекций и при приближении к центру толстых образцов, качество изображения значительно улучшается по сравнению с визуализацией однонаправленным методом. В качестве альтернативы, можно использовать поворот светового "листа". Этот метод называется многонаправленной селективной микроскопией плоскостного освещения (mSPIM). Световые «листы», распространяющиеся от осветительного(ых) объектива(ов), поворачиваются в фокальной плоскости детектирования на угол приблизительно равный 10o с использованием резонансного зеркала, работающего на высокой частоте. Освещение под несколькими углами реализуется практически одновременно от каждого осветительного объектива во время экспозиции камеры, уменьшая помехи освещения без ущерба для скорости захвата, как при визуализации разных проекций. Однако для уменьшения помех этот подход не так эффективен, как мультипроекционная селективная микроскопия плоскостного освещения, поскольку диапазон углов освещения все еще относительно ограничен. Многопроеционную и многонаправленную визуализацию можно комбинировать для повышения чувствительности.
Существуют некоторые вопросы относительно метода визуализации с поворотом образца, в первую очередь потому, что он увеличивает время сбора данных в несколько раз. Вращение образца может быть проблематичным из-за времени вращения, которое, как правило, измеряется в десятках миллисекунд. Медленное вращение необходимо для предотвращения механического напряжения и перемещения образца, что может поставить под угрозу эксперимент или привести к появлению «рывковых» помех, при которых образец резко перемещается между кадрами изображения. Кроме того, каждая плоскость подвергается воздействию освещения в несколько раз дольше, чем в сопоставимых экспериментах в флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения с визуализацией одной проекции. Это связано с необходимостью изображения объектов в каждой плоскости 4-6 раз. Такое увеличенное время сбора данных часто препятствует визуализации живых образцов. Таким образом, данная техника в большей степени способствует высококачественной структурной визуализации неподвижных образцов.
Популярной альтернативой и/или дополнением к визуализации нескольких проекций является двухстороннее освещение световым «листом»: пара противоположно направленных осветительных объективов обеспечивают чередующееся (или одновременное) освещение световым «листом» с противоположных сторон образца, что обеспечивает более однородное освещение элементов образца. Детектирующие объективы размещены по-прежнему ортогонально обоим осветительным объективам. Это быстрый и элегантный подход для уменьшения эффекта возникновения полос/теней в результате одностороннего освещения. Кроме того, при правильном выравнивании двусторонняя подсветка может использоваться для эффективного удвоения конфокального параметра, что позволяет использовать «тонкие» световые «листы» для получения изображений более крупных образцов с более высоким разрешением, но без процессов бокового сканирования и сшивания, используемых в sTSLIM, HROPFOS и подобных техниках LSFM.
Как уже говорилось, DSLM и аналогичные методы имитируют световые листы путем сканирования типичного коллимированного лазерного луча с гауссовским распределением как в поперечном, так и в осевом направлении через образец. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он обеспечивает более однородную световую дозировку, чем статические плоские световые "листы". Он предпочтителен для количественных применений визуализации. Кроме того, DSLM не требует апертуры для формирования луча, уменьшая оптические аберрации и приводя к эффективности освещения приблизительно 90-95%, по сравнению с приблизительно 5% для плоских световых "листов". Это позволяет использовать гораздо более дешевые и маломощные лазерные источники света. Наконец, DSLM и связанные с ним методы позволяют создавать новые схемы освещения посредством модуляции интенсивности освещения с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF).
Многие недавние стандартизированные подходы к высокочувствительным LSFM предполагают использование четырех объективов: двух для освещения и двух для детектирования. Большим преимуществом этого метода является то, что он удваивает количество света, собираемого в каждой плоскости. Стандартизированные платформы обработки изображений SiMView и MuVi-SPIM популяризируют данную технику. Совсем недавно был введен вариант IsoView, в соответствии с которым возбуждение световым листом и детектирование флуоресценции выполняются четырьмя изготовленными на заказ объективами последовательно, и каждый из них имеет собственную камеру sCMOS для регистрации, что позволяет собирать регистрировать четыре проекции без физического вращения образца. В ранней технике, получившей название микроскопии с несколькими осями визуализации (MIAM), также использовались 4 объектива, но они были расположены в форме тетраэдра и обеспечивали изотропное разрешение, также без вращения образца.
Руководства по сборке высококачественных приборов для микроскопии плоскостного освещения, включая SiMView, MuVi-SPIM, IsoView и OpenSPIM с открытым исходным кодом, помогают стандартизировать системы. Кроме того, программное обеспечение и алгоритмы SPIM доступны из этих источников. Со временем LSFM, скорее всего, достигнет той же степени коммерческой доступности и стандартизации, которой пользуются другие методы микроскопии.
Селективная микроскопия плоскостного освещения iSPIM, diSPIM и SPIM triple view
Внедрение методов инвертированной селективной микроскопии плоскостного освещения (iSPIM) в лаборатории Хари Шроффа представило новый мощный подход в адаптации флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения для широкого использования. Микроскоп для iSPIM состоит из «головки», к которой прикреплены осветительный и детектирующий объективы. Ориентация осветительных и детектирующих объективов "сверху" позволяет использовать более традиционные методы подготовки образцов (например, выращивание клеток на покровном стекле). Данный подход контрастирует с бол
Товары
-
-
Арт. oSPIM -
Арт. diSPIM -
Арт. Mizar TILT -
Арт. L-SPI
- Комментарии
Загрузка комментариев...
Наши специалисты ответят на любой интересующий вопрос по услуге
Задать вопрос
Привлекательные цены
Всегда выгодные предложения
