Арт. OptoSpin IV
Флуоресцентные микроскопы и системы визуализации используют флуоресцентные биомаркеры и наборы флуоресцентных фильтров для создания ярких и высококонтрастных изображений биомолекул, органелл, клеток, тканей, органов и их систем. Поскольку качество изображения во многом зависит от конструкции и общей производительности флуоресцентных фильтров, интегрированных в эти системы, характеристики оптических фильтров так же важны для конечного изображения, как подготовка образца и выбор флуорофора.
Рис 1. Схема оптического путь флуоресцентного микроскопа с фильтрами
Флуоресценция
Когда фотон света определенной длины волны поглощается атомом или молекулой, орбитальный электрон перескакивает из своего основного состояния (S0) в возбужденное синглетное состояние (S1). Когда электрон возвращается в свое основное состояние, излучается фотон с меньшей энергией и, следовательно, с большей длиной волны, чем у фотона, который был первоначально поглощен (рис. 2). Это явление, известное как флуоресценция, является ключевым понятием, лежащим в основе большого количества инструментов, используемых в биологической науке и медицине. Флуоресцентные микроскопы, системы визуализации, проточные цитометры и секвенаторы ДНК используют источник света, такой как лазер, светодиод или широкополосная лампа, для возбуждения флуоресцентных меток в образце. Флуоресцентные фильтры используются для выделения и направления возбуждающего сигнала к образцу и эмиссионного сигнала к детектору или окуляру (рис. 1).
В некоторых случаях несколько длинноволновых фотонов могут одновременно поглощаться одним атомом или молекулой, в результате чего излучаемый фотон имеет более высокую энергию и более короткую длину волны, чем те, которые были изначально поглощены (рис. 2). Этот нелинейный флуоресцентный отклик используется в системах двухфотонной и многофотонной флуоресцентной микроскопии. Однако электрон в возбужденном состоянии также может вернуться в основное состояние с помощью других процессов, также используемых в микроскопии; они включают резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и истощение стимулированного излучения (STED).
Рис 2. Диаграммы Яблонского, показывающие разницу между линейной флуоресценцией (слева) и двухфотонным возбуждением (справа).
Флуоресцентные метки
Образцы, изучаемые с помощью флуоресценции, обычно помечены или содержат вещества, называемые флуорофорами (или флуорохромами), которые излучают относительно сильный эмиссионный сигнал как свойство их ароматических химических структур. Все флуорофоры имеют уникальный спектр поглощения (или возбуждения) и уникальный спектр излучения, каждый из которых имеет пик энергии или интенсивности на определенной длине волны. Разница длин волн между пиковым поглощением и пиковым излучением данного флуорофора известна как стоксов сдвиг (рис. 3), который может варьироваться от нескольких до сотен нанометров.
Рис 3. Спектры поглощения и излучения флуоресцеинизотиоцианата (FITC). Стоксов сдвиг - это разность спектральных пиков.
Большое разнообразие флуоресцентных белков, зондов, красителей и других флуорофоров доступно для использования в качестве флуоресцентных меток. Каждый из них имеет разные спектры возбуждения и излучения и разный стоксов сдвиг, и все они различаются по яркости, времени выхода в рабочий режим и фотостабильности. Кроме того, интенсивность излучения зависит от длины волны света, поглощаемого флуорофором; свет, соответствующий пику поглощения, приведет к максимальной интенсивности излучения, в то время как свет с длинами волн, более далекими от пика поглощения, будет давать сигнал излучения меньшей интенсивности. Сила эмиссионного сигнала также варьируется в зависимости от концентрации меченых молекул. Некоторые флуоресцентные системы, например, предназначены для обнаружения сигнала излучения одной молекулы.
Наборы флуоресцентных фильтров
Для правильной работы эпифлуоресцентных и других стандартных флуоресцентных микроскопов требуются три типа оптических фильтров: (1) фильтр возбуждения, (2) запирающий фильтр и (3) дихроичный светоделитель (рисунки 1 и 4). Фильтры возбуждения и запирающие фильтры представляют собой полосовые фильтры, которые пропускают диапазон длин волн, который соответствует нужному спектру поглощения или излучения флуорофора, блокируя при этом посторонний свет с обеих сторон. Однако, в случаях, когда яркость изображения важнее контраста, фильтры излучения также могут быть краевыми фильтрами, которые пропускают более длинные волны, а не блокируют их. Большинство дихроичных светоделителей представляют собой длинноволновые фильтры, предназначенные для использования при угле падения 45 ° (AOI). Дихроичные фильтры направляют отфильтрованный возбуждающий свет к образцу, а излучаемый свет от образца через эмиссионный фильтр к детектору (рис. 1).
Рис 4. Набор флуоресцентных фильтров, предназначенный для использования с FITC.
Наборы флуоресцентных фильтров могут быть одно- или многополосными и могут существовать в нескольких конфигурациях. Наиболее распространенные комбинацию объединяют в кубы или колеса фильтров. Несколько наборов однополосных фильтров можно использовать для образцов, помеченных более чем одним флуорофором, путем получения серии изображений с каждым соответствующим кубом фильтров и последующего создания окончательного составного изображения. Этого также можно добиться с помощью колес фильтров Pinkel или Sedat. Наборы фильтров Pinkel состоят из многополосного запирающего фильтра и полихроичного фильтра, которые используются вместе с несколькими однополосными фильтрами возбуждения. Наборы фильтров Sedat состоят из полихроичного фильтра, который используется вместе с несколькими однополосными запирающими фильтрами и фильтрами возбуждения.
Также доступны полностью многополосные наборы фильтров, состоящие из многополосного фильтра возбуждения, многополосного фильтра излучения и полихроичного фильтра, которые будут создавать одно изображение, содержащее все флуоресцентные метки.
Требования к набору флуоресцентных фильтров
Чтобы создать набор флуоресцентных фильтров, который дает высококачественное изображение с черным фоном и высокой контрастностью, фильтры возбуждения и запирающие фильтры должны обеспечивать высокую пропускаемость с минимальной флуктуацией полосы пропускания в областях, соответствующих пиковому возбуждению или излучению флуорофора, и их соответствующие полосы пропускания должны быть разделенными так, чтобы перекрытия не возникали выше уровня OD7 (-70 дБ или 0,00001% пропускания) (Рисунок 5). Однако перекрытия OD6 (передача -60 дБ или 0,0001%) или OD5 (передача -50 дБ или 0,001%) приемлем при использовании флуорофора с очень коротким стоксовым сдвигом или в случае некоторых наборов многополосных фильтров.
Рис 5. Передаточная функция набора высокоэффективных флуоресцентных фильтров. Характеристики фильтров, обеспечивающие высокую контрастность и черный фон, выделены.
Для достижения условия не перекрытия выше OD7 флуоресцентные фильтры должны быть разработаны как набор. Фильтры возбуждения и запирающие фильтры также должны иметь крутые края полос пропускания, которые переходят от блокировки OD6 к пропусканию более 90% всего за несколько нанометров, чтобы позволить полосам пропускания захватывать соответствующие пики флуорофора. Большинство наборов флуоресцентных фильтров спроектировано так, что теоретические полосы запирающих фильтров и фильтров возбуждения выходят за пределы OD7, чтобы учесть производственные допуски. Поскольку измеренные спектры фильтров с покрытием могут отклоняться от теоретических данных, также важно обеспечить соответствующее перекрытие. Примером может служить задание относительно жесткого допуска по центральной длине волны или определение абсолютного диапазона передачи или блокировки вместо среднего.
Чтобы получить черный фон, фильтры возбуждения и эмиссии должны быть спроектированы так, чтобы блокировать любой посторонний свет. Это достигается за счет широких диапазонов блокировки вне полосы пропускания, на уровне OD6 или выше. Для систем, в которых используются широкополосные источники света, требуются диапазоны блокировки от ~ 300 до ~ 1100 нм вне полосы пропускания, в то время как для переключаемых светодиодных источников света требуется блокировка от ~ 300 до ~ 850 нм. Запирающие фильтры для лазерных систем требуют оптической плотности, по крайней мере, OD6, абсолютной блокировки лазерной линии, в то время как диапазоны блокировки вне полосы могут быть аналогичны фильтрам излучения для светодиодных источников света. Если окружающий свет не является проблемой, тогда фильтры возбуждения для лазерных систем могут не предоставлять блокировку в широком диапазоне за пределами полосы пропускания фильтра эмиссии.
Дихроичные фильтры также должны иметь относительно крутой переход между полосами отражения и пропускания, чтобы обрезанный край располагался между полосами пропускания фильтров возбуждения и эмиссии. Кроме того, все фильтры, пропускающие свет к детектору или окуляру, должны иметь низкое искажение передаваемого волнового фронта (TWE), чтобы избежать искажения изображения.
Плоскостность дихроичных фильтров
Плоскостность поверхности дихроичного светоделителя - это свойство, которое следует учитывать при выборе набора флуоресцентных фильтров для лазерных систем, систем визуализации, TIRF микроскопии (флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения) и систем сверхвысокого разрешения. Когда тонкопленочное покрытие наносится на подложку, напряжение покрытия заставляет подложку изгибаться, в результате чего получается чашеобразная или куполообразная кривизна (рис. 6). Эта кривизна, вызванная напряжением покрытия, вызывает усиление искажения отраженного волнового фронта (RWE), что может привести к смещению фокуса и искажению размера пятна в этих системах. Следовательно, необходимо покрытие с низким напряжением (рис. 7) или компенсация обратной стороны, чтобы избежать деформации.
Рис 6. Интерферограмма, показывающая кривизну, вызванную напряжением покрытия, которое может привести к искажению изображения.
Рис 7. Интерферограмма, показывающая плоский дихроичный фильтр с низким напряжением покрытия.
Однако для стандартных широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов, оснащенных широкополосной лампой или светодиодным источником света, обычно такой высокой плоскостности поверхности не требуется. Большинство этих систем сконфигурированы так, что дихроичный свет передает излучение на детектор, поэтому TWE необходимо контролировать, но плоскостность поверхности вряд ли повлияет на конечное качество изображения.
Нулевой сдвиг пикселей
Флуоресцентные фильтры должны быть оптимизированы для получения нулевого сдвига пикселей, когда они используются в любой конфигурации, где происходит переключение между разными фильтрами, чтобы визуализировать несколько флуорофоров в одном образце. Эти конфигурации включают наборы одноканальных фильтров, наборы Pinkel и наборы Sedat. Эмиссионные фильтры и дихроичные фильтры, используемые в этих конфигурациях, должны быть получены от одного производителя и иметь высокую степень параллелизма, чтобы минимизировать отклонение луча, вызванное углом клина. Поскольку большинство фильтров не идеально параллельны, и поскольку напряжение покрытия приводит к определенному уровню отклонения луча, между изображениями, снятыми до и после введения в систему оптических фильтров, будет происходить некоторый сдвиг пикселей. Однако при сравнении изображений, снятых с наборами с нулевым сдвигом пикселей, которые были разработаны для совместной работы, сдвиг должен быть менее, чем примерно ± 1 пиксель.
Минимизация перекрестных помех
При использовании многополосных наборов фильтров и наборов Pinkel для визуализации образцов, помеченных несколькими флуорофорами, важно минимизировать перекрестные помехи. Минимизация перекрестных помех также является важным фактором для таких приложений, как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), FRET и проточная цитометрия. Перекрестные помехи, или "просачивание", возникают, когда сигналы возбуждения и излучения одного флуорофора передаются через канал фильтра, зарезервированный для другого флуорофора, что приводит к смешению цветов в одном месте, которое имитирует эффект совместной локализации.
Хотя определенное количество перекрестных помех неизбежно, важно выбрать флуорофоры и наборы фильтров, которые минимизируют этот эффект. Этого можно достичь, избегая комбинаций флуорофоров, у которых есть большое перекрытие между их соответствующими спектрами излучения. Также следует избегать перекрытия между спектрами поглощения в тех случаях, когда каждый флуорофор возбуждается разным светом светодиода или лазера. Независимо от выбора флуорофора, фильтры возбуждения и эмиссии должны быть разработаны с относительно узкими полосами пропускания, которые улавливают пиковое возбуждение или испускание целевого флуорофора, при этом блокируя как можно больше перекрытий (рис. 8).
Рис. 8. Пример многополосного эмиссионного фильтра, который был разработан для минимизации перекрестных помех между флуорофорами. Обратите внимание, что перекрестные помехи во втором канале неизбежны из-за перекрытия спектров излучения между CFP и TurboYFP.
Минимизация дисперсии групповой задержки
Для систем нелинейной оптики (NLO), в которых для возбуждения используется импульсный фемтосекундный лазер, требуется оптика, которая управляет фазовым сдвигом и дисперсией групповой задержки (GDD). В этих приборах импульсный луч проходит через несколько различных оптических компонентов или отражается от них, прежде чем в конечном итоге достигнет образца. Если эти оптические фильтры и зеркала не предназначены специально для использования с фемтосекундными лазерами, пиковая интенсивность импульса будет уменьшаться из-за дисперсии групповой задержки каждый раз, когда последовательность импульсов отражается или проходит (рисунок 9). Поскольку уменьшение пиковой интенсивности импульса приведет к уменьшению количества сигналов NLO, этот комбинированный эффект в конечном итоге приведет к плохой работе прибора.
Рисунок 9. Диаграмма, иллюстрирующая влияние дисперсии групповой задержки (GDD).
Дихроичные фильтры и зеркала с регулируемой дисперсией позволяют одновременно управлять фазой и амплитудой лазерного излучения (рис. 10), что приводит к минимальной дисперсии и минимальным потерям пиковой интенсивности импульса.
Рис. 10. Зеркало с высоким коэффициентом отражения, предназначенное для управления GDD в большом диапазоне длин волн.
Фильтры Alluxa
Все флуоресцентные фильтры Alluxa имеют твердое покрытие, нанесенное с использованием инновационного процесса плазменного осаждения SIRRUS. Этот процесс позволяет Alluxa производить высокоэффективные фильтры возбуждения, эмиссии и дихроичные фильтры с крутыми краями между областью пропускания и блокировки, пропусканием, обычно превышающим 95%, точным контролем длины волны, глубокой блокировкой и низким уровнем искажения волнового фронта, которые также оптимизированы для получения нулевого сдвига пикселей.
Дихроичные светоделители Alluxa для работы с лазером, визуализации, TIRF микроскопии и приложений со сверхвысоким разрешением могут достигать уровней плоскостности λ / 2 на дюйм или лучше на подложках толщиной 1.05 мм и уровней λ / 10 на дюйм или лучше на более толстых подложках. Alluxa также предлагает зеркала с высоким коэффициентом отражения и дихроичные фильтры с низким уровнем дисперсии групповой задержки в широком диапазоне длин волн.
Независимо от того, разрабатываете ли вы OEM систему для регистрации флуоресценции или собираетесь приобрести куб фильтров для готовой системы, мы поможем Вам подобрать решение, которое наилучшим образом соответствует вашим конкретным требованиям.
