Арт. BC43
Автор: Dr Claudia Florindo
Оглавление
- Микроскоп BC43 Andor Technology
- Гормон щитовидной железы в процессах метаморфоза
- Исследование молекулярных механизмов развития и метаморфоза
Рисунок 1 - Изображение головы плоской рыбы, полученное с помощью микроскопа BC43 в режиме конфокальной визуализации.
На рисунке 1 метаморфирующие личинки рыбы были окрашены ацетилированным тубулином для изображения нейронов (желтый), а полосатые мышцы - антимиозиновой сывороткой с тяжелой цепью (голубой). Это изображение иллюстрирует высокую детализацию и разрешение отдельных аксонов (желтый цвет). Изображение получено с помощью Andor BC43 с использованием многократного мозаичного сбора данных, монтажа и объектива с большим рабочим расстоянием 40X. Было получено 48 изображений, 175 срезов, в диапазоне Z 330 мкм. Полученное изображение было подвергнуто деконволюции и сшито. Можно наблюдать идеальную сшивку. Изображение было обработано с помощью ПО Imaris (Изображение предоставлено Марко Кампиньо, CBMR Universidade do Algarve и Клаудией Флориндо, Andor Technology).
Обзор конфокального микроскопа BC43 Andor Technology
BC43 - это новая высокоскоростная конфокальная система компании Andor, которая представляет собой настольный конфокальный микроскоп, обеспечивающий превосходное качество визуализации по уникальной цене. С помощью BC43 пользователь может выбирать различные режимы визуализации в зависимости от экспериментальных целей. Способы визуализации включают:
- Высококачественная конфокальная флуоресцентная визуализация
- Широкопольная эпифлуоресцентная визуализация;
- Визуализация без использования лазера (проходящий свет).
BC43 - это идеальная система для множества приложений в области наук о жизни. Одним из таких приложений является биология развития. Конфокальный микроскоп BC43 решает проблемы трехмерной визуализации в биологии развития. Используя BC43 Andor, исследователи могут легко изучать развитие от самых первых делящихся клеток до целого организма. Он обеспечивает быструю визуализацию с высоким разрешением развивающихся модельных организмов. Кроме того, он позволяет получать изображения глубже, чем обычные флуоресцентные микроскопы, и в 10 раз быстрее, чем традиционные конфокальные системы.
Визуализация развития сосудов данио-рерио в режиме реального времени
На видео выше снята визуализация развития сосудов трансгенной данио-рерио (показано голубым цветом) в сочетании с DPC (дифференциальным фазовым контрастом) в сером цвете. Визуализация проводилась с 28hpf до 36hpf (hpf - часы с момента оплодотворения). Изображение было получено с помощью конфокальной системы визуализации Andor BC43. В протоколе визуализации были активированы режимы тайм-лапса и сшивания. В каждой временной точке было получено девять плиток, как для конфокального канала, так и для канала DPC, охвачен диапазон 633 мкм. Полученное изображение было подвергнуто деконволюции и сшито с помощью программного обеспечения Imaris. (Изображение предоставлено Марко Кампиньо, Университет Алгарве, и Клаудией Флориндо, Andor Technology).
Основные сложности, возникающие в экспериментах в области биологии развития, и способы их преодоления с помощью конфокального микроскопа Andor BC43 представлены в следующей таблице:
|
Проблема |
Решение |
|
Толстые образцы Как получить изображение в глубине толстых образцов? |
|
|
Визуализация живых образцов Как проводить визуализацию живых образцов без фототоксичности или фотообесцвечивания |
|
|
Изображение больших образцов Получение полных изображений крупных образцов Визуализация нескольких живых образцов Получение значительных объемов данных за короткий промежуток времени |
|
Отзыв пользователя
Доктор Марко Кампиньо – специалист в биологи развития, чьи исследования посвящены молекулярным механизмам метаморфоза. В частности, доктор Кампиньо стремится понять, как гормон щитовидной железы контролирует этот процесс развития. В своих исследованиях он изучает крупные модельные организмы (данио-рерио и камбалу). Доктор Кампиньо протестировал конфокальный микроскоп Andor BC43, чтобы понять, насколько хорошо он подходит для подобных исследований в области биологии развития.
В течение последних десяти лет я использовал для получения живых изображений широкопольные, конфокальные и LSF микроскопы от ведущих брендов. Вчера мне потребовалось всего 30 минут, чтобы подготовить восемь эмбрионов для получения живых изображений в течение 24 часов. Это был самый быстрый и простой способ, который я когда-либо испытывал в своей карьере. Мне очень нравится система BC43 Доктор Марко Кампиньо (руководитель группы в Университете Алгарве)
Рисунок 2 - Цельное тело данио-рерио на кульминационном этапе развития.
На рисунке 2 представлена максимальная проекция ромбовидного мозга (ромбэнцефалона) данио-рерио на 48hpf (hpf - часы с момента оплодотворения) после иммуномаркировки нейронов (анти-HuC/D сыворотка, желтый), глии (анти-zrf сыворотка, пурпурный). Ядра были помечены DAPI (голубой). Изображение получено на Andor BC43 с использованием многократного получения и монтажа плиток. Для составления изображения было получено 30 фрагментов, каждый фрагмент имел 175 срезов, в диапазоне Z 370 мм. (Изображение предоставлено Марко Кампиньо, Университет Алгарве).
Обзор роли гормонов щитовидной железы в метаморфозе
Гормоны - это важные молекулы, которые регулируют деятельность всех многоклеточных организмов. Гормоны можно описать как "молекулы-посланники", вырабатываемые и выделяемые эндокринной системой, которые контролируют гомеостаз всего организма. Эндокринная система состоит из множества желез, каждая из которых вырабатывает определенные гормоны. Щитовидная железа - одна из желез эндокринной системы. Щитовидная железа производит гормон Т4 (предшественник тиреотропного гормона). Т4 подвергается местной активации, в результате чего образуется Т3 (активный тиреотропный гормон). Функция гормонов щитовидной железы в физиологии позвоночных имеет важное значение на всех этапах жизни - от эмбрионального развития до гомеостаза взрослого организма.
Среди различных функций развития, зависящих от гормона щитовидной железы, выделяется развитие человеческого мозга. Низкий уровень циркулирующих гормонов щитовидной железы у беременных женщин приводит к тяжелым неврологическим дефектам у новорожденных. Некоторые другие заболевания также были связаны с де-регуляцией системы щитовидной железы, такие как болезнь Грейвса-Базедова (ДТЗ), тиреоидит Хашимото (ХАИТ), а в последнее время становится очевидной роль гормона в клинической депрессии. Тиреоидный гормон очень важен для развития и физиологии позвоночных; его роль в развитии была впервые установлена при метаморфозе амфибий Anuran (Allen, 1925). Дальнейшие исследования показали, что, как и у Anuran, Т3 необходим для метаморфоза лучеперых рыб (Inui and Miwa, 1985). Совсем недавно лаборатория Кампиньо доказала, что Т3 является важным регулятором эмбрионального развития, роль которого сохраняется от рыб до млекопитающих (Campinho et al., 2014).
Современные исследования установили, что гормон щитовидной железы является ключевым регулятором развития. Тем не менее, для полного понимания регуляции и нюансов, связанных с функцией развития Т3, необходимо провести еще много исследований. Поскольку тиреотропный гормон Т3 оказывает такое большое влияние на общее развитие и гомеостаз позвоночных организмов, очевидно, что лучшее знание функции Т3 в целом позволит разработать терапевтически направленные исследования, которые будут способствовать облегчению бремени, связанного с нарушениями, связанными с Т3.
Рисунок 3 – Изображение камбалы, полученное с помощью конфокального микроскопа BC43
На рисунке 3 представлена плоская рыба в начале кульминационной стадии метаморфоза, окрашенная ацетилированным тубулином для маркировки нейронов (голубой) и тяжелой цепью миозина полосатых мышц (желтый). Изображение получено с помощью конфокального микроскопа Andor BC43 с использованием многократного получения и «склеивания» фрагментов изображений. Для составления изображения было получено 6 плиток, каждая из которых состояла из 175 срезов в диапазоне Z 521 мкм. Изображение было обработано в программе Imaris. (Изображение предоставлено Марко Кампиньо, Университет Алгарве, и Клаудией Флориндо, Andor Technology).
Пример применения в биологии развития - исследование молекулярного механизма развития и метаморфоза
Лаборатория Кампиньо стремится понять клеточные и молекулярные основы развития позвоночных животных от эмбрионального развития до метаморфоза. Учитывая широко распространенную роль Т3 в развитии (включая эмбриональное развитие и метаморфоз), лаборатория решила сосредоточить исследования на молекулярной функции гормонов щитовидной железы. Для достижения целей исследования лаборатория использует данио-рерио и камбалу в качестве модельных организмов.
Рисунок 5 - Марко Кампиньо (руководитель группы, слева) и кандидат наук Андре Андраде (справа) в лаборатории
В настоящее время лаборатория осуществляет два основных исследовательских проекта:
1) Как гормон Т3 создает разнообразие клеток во время нейроразвития данио-рерио?
Понимание молекулярных механизмов T3 в нейронном развитии данио-рерио будет способствовать развитию знаний об общих молекулярных и клеточных механизмах сигнализации T3. Лаборатория Кампиньо показала, что материнский Т3 необходим и отвечает за создание необходимого разнообразия клеток и, следовательно, способствует развитию полноценно функционирующей центральной нервной системы (Campinho et al 2014). Используя данио-рерио, лаборатория разработала первую позвоночную модель синдрома Аллана-Херндона-Дадли (САГД, AHDS). Важно, что модельная рыба позволяет фенокопировать (имитировать) неврологические симптомы, наблюдаемые у пациентов-людей.
В будущем лаборатория намерена продолжить разработку генномодифицированных данио-рерио с потерей функции для транспортеров и рецепторов T3; и ожидает, что знания, полученные в результате этих исследований, будут способствовать более глубокому пониманию синдромов, связанных с T3.
Рисунок 5 - Ромбовидный мозг (ромбэнцефалон) данио-рерио
Изображение 5 показывает двойную флуоресцентную гибридизацию in situ ромбовидного мозга данио-рерио в течение 24 часов. Изображение получено с помощью конфокального микроскопа Andor BC43. Изображение предоставлено Марко Кампиньо, Университет Алгарве.
2) Как метаморфоз камбалы приводит к развитию асимметричных позвоночных?
Исследовательская группа Кампиньо также занимается изучением основных механизмов метаморфоза. Используя камбалу Solea senegalensis, лаборатория направила усилия на понимание того, какие механизмы определяют асимметричное метаморфическое развитие. Группа смогла разгадать молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе асимметричного метаморфического развития камбалы, когда миграция одного глаза на другую сторону головы происходит в результате асимметричной передачи сигналов T3 и оссификации (Campinho et al., 2018).
В целом, лаборатория Кампиньо нацелена на изучение клеточных и генетических механизмов, которые определяют регуляцию развития позвоночных гормонами щитовидной железы. В частности, лаборатория стремится расшифровать:
- Значение T3-сигнализации и ее перенос на заболевания человека.
- Фундаментальные механизмы морфогенеза.
Неудивительно, что для достижения поставленных целей в лаборатории используются различные молекулярные и визуализационные методы, включая:
1) трансгенные генетические модели данио-рерио и CRISPR/Cas9,
2) фармакологические подходы,
3) OMICs и передовые методы микроскопии.
Группа использует долгосрочную (40 часов) визуализацию развивающихся эмбрионов данио-рерио в реальном времени, а также разрабатывает методы увеличения качества изображений, позволяющие получать цельные изображения высокого разрешения метаморфических личинок камбалы с помощью системы визуализации BC43.
В области микроскопии нам приходится преодолевать несколько сложных технических препятствий. В частности, при метаморфозе, учитывая большой размер образцов, подлежащих изображению (толщина 1-1,7 мм). Доктор Марко Кампиньо (руководитель группы в Университете Алгарве)
Доктора Кампиньо дал также дополнительные комментарии по поводу тестирования нового настольного конфокального микроскопа Andor BC43 для его исследований в области регуляции гормонов щитовидной железы:
Система Andor на базе технологии вращающегося диска позволяет преодолевать технические сложности»
