Арт. GATTANALYSIS
В последние годы пространственное разрешение во флуоресцентной микроскопии значительно улучшилось благодаря изобретению нескольких методов микроскопии сверхвысокого разрешения, которые преодолевают дифракционный предел. Тем не менее, проверка и тестирование этих новых методов остается сложной задачей из-за отсутствия надежных тестовых структур, обеспечивающих четко определенные расстояния от метки к метке. Недавно разработанные наноструктуры позволяют позиционировать молекулы красителя с точностью до нанометра и могут изготавливаться в очень параллельной структуре. Эти структуры могут быть использованы для проверки достижимого пространственного разрешения систем микроскопии сверхвысокого разрешения, но также и обычных флуоресцентных микроскопов.
Мотивация
Первое десятилетие 21-го века было ознаменовано значительным развитием методов оптической микроскопии. Предел оптической дифракции, постулированный Эрнстом Аббе в 1873 году, был преодолен изобретением нескольких методов микроскопии сверхвысокого разрешения, которые позволяют получить пространственное разрешение до шести нанометров [1]. Стоимость, которую должны платить пользователи микроскопов супер-разрешения, чтобы добиться улучшенного пространственного разрешения, это повышенная сложность в обработке настроек и подготовке образцов, а также оценка данных. Как следствие, больше нельзя рассчитать достижимое пространственное разрешение для этих новых методов микроскопии просто глядя на технические характеристики микроскопа. Поскольку пространственное разрешение по существу является наиболее важным параметром любого микроскопа для пользователей, производителей и разработчиков важно, чтобы была возможность измерить достижимое пространственное разрешение микроскопа экспериментальным путем. Обычно пространственное разрешение демонстрируется и измеряется путем визуализации клеточных структур, таких как микротрубочки или актиновые нити. Тем не менее, эти образцы имеют пару недостатков, таких как тот факт, что они не предоставляют большое количество идентичных образцов с определенными расстояниями между флуоресцентными метками, и они не очень хорошо определяются относительно плотности маркировки и расстояния между красителями. Эти недостатки делают практически невозможным их использование в качестве надежного и объективного образца-тестера для проверки пространственного разрешения современных флуоресцентных микроскопов.
Рис. 1: Нанолинейки для различных методов визуализации: (а) Дифракционно-ограниченная конфокальная визуализация. Расстояние между двумя флуоресцентными метками составляет 350 нм. Краситель Alexa488, (б) Микроскопия структурированного освещения. Расстояние между флуоресцентными метками составляет 160 нм. Краситель Alexa568, (c) STED микроскопия. Расстояние между флуоресцентными метками составляет 71 нм. Краситель ATTO647N, (d) Образец для dSTORM микроскопии. Расстояние между флуоресцентными метками составляет 94 нм. Краситель Alexa647, (e) Образец на основе микроскопии локализации с использованием техники ДНК-краски. 3 двухцветных пятна подряд. Расстояние между двумя соседними точками составляет 80 нм. Красители Atto655 и Atto550. Этот двухцветный образец также можно использовать для проверки хроматических аберраций.
Маркеры-нанолинейки на основе ДНК технологии
Методика, которая позволяет создавать тестовые образцы, удовлетворяющие всем требованиям указанным выше, представляет собой так называемую технику ДНК-оригами [2]. Упрощенно, структуры ДНК-оригами можно рассматривать как наноразмерные молекулярные шаблоны, которые позволяют позиционировать молекулы красителя, флуоресцентные белки или по существу любой объект, который может быть связан с одноцепочечной ДНК. Структуры ДНК-оригами могут производится параллельно и в собранном виде возможно использовать их как повсеместно доступные образцы.
Схематичное изображение типичного тестового образца, так называемый маркер-нанолинейка на основе ДНК-оригами, можно увидеть на рисунке 1. Обычно от двух до трех флуоресцентных меток, каждая из которых состоит из нескольких органических молекул красителя, расположеных на каждой структуре ДНК-оригами. Расстояние между этими флуоресцентными метками может регулироваться по желанию в диапазоне 6-360 нм. Количество молекул красителя на флуоресцентной метке находится в диапазоне 10-20 и по сути каждый обычно используемый вид красителя может быть прикреплен к маркеру-нанолинейке. Тест-образцы нанолинеек могут быть готовыми к использованию путем иммобилизации структуры ДНК-оригами на покровном стекле с плотностью около 1 структуры на мкм2, что означает, что в пределах типичного поля зрения объектива будут видны сотни одинаковых нанолинеек. Это позволяет измерить расстояния между флуоресцентными метками, таким образом, чтобы проверить пространственное разрешение микроскопа и рассчитать статистические ошибки для этих измерений. Из-за большого количества одинаковых структур можно использовать эффективные алгоритмы, которые автоматически обнаружат нанолинейки в изображениях сверхвысокого разрешения и измерят расстояния между флуоресцентными метками (рис. 2).
Рис. 2: Программное обеспечение для полуавтоматического анализа данных измерений с помощью нанолинеек. (а) Программное обеспечение (GATTAnalysis компании GATTAquant GmbH) идентифицирует правильно отображенные нанолинейки. (б) Расстояния между различимыми флуоресцентными метками измеряются программным обеспечением. Теоретическое расстояние между двумя соседними метками составляет 80 нм. (c) Гистограмма измеренных расстояний. Измеренное значение (79.3 ± 1.8) нм очень хорошо соответствует теоретическому значению 80 нм.
Готовые образцы маркеров-нанолинеек можно хранить месяцами в холодильнике и измерять пространственное разрешение микроскопа на ежедневной основе [3]. Маркеры-нанолинейки на основе ДНК-оригами могут быть оптимизированы для каждого метода микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как STED [4], SIM [5] или методы микроскопии основанные на локализации, например, dSTORM, PALM, GSDIM или DNA-PAINT [6,7,8,9], а также для обычных конфокальных изображений, как показано на рисунке 1. Нанолинейки используются научными лабораториями для оптимизации изображений, обучению основам микроскопии сверхвысокого разрешения, для анализа работы микроскопа и для того, чтобы решить какая коммерческая установка для визуализации в микроскопии лучше всего подходит для конкретных потребностей данной лаборатории. Производители коммерческих микроскопов сверхвысокого разрешения и флуоресцентных микроскопов используют маркеры-нанолинейки не только для демонстрации того, что их продукты соответствуют техническим характеристикам и заявленному пространственному разрешению, но также и для развития новых методов и систем для микроскопии.
Стандарты яркости
Помимо контроля за положением молекулы красителя и, следовательно, за положением флуоресцентных меток, можно также очень точно контролировать количество молекул красителей на структуре ДНК-оригами и положение одной точки ограниченной дифракцией. Кроме того, также можно контролировать расстояние между молекулами красителя на структуре ДНК-оригами, которое может использоваться для предотвращения нежелательных фотофизических эффектов таких, как гашение, которое потенциально уменьшает интенсивность флуоресценции. Было показано, что интенсивность флуоресценции масштабируется линейно с числом молекул красителей на структуре ДНК-оригами [10]. Эти свойства позволяют использовать меченые красителем структуры ДНК-оригами как стандарты яркости, чтобы посчитать абсолютные количества флуоресцентных красителей во флуоресцентных образцах.
Выводы
Новые методы оптической флуоресцентной визуализации обеспечивают десятикратное увеличение пространственной разрешающей способности. Тем не менее, пробоподготовка, настройка микроскопа и анализ данных очень сложны, и это не позволяет рассчитать достижимое пространственное разрешение. Маркеры-нанолинейки на основе ДНК-оригами являются идеальными тестовыми образцами, которые предлагают определенные расстояния между флуоресцентными метками и могут быть иммобилизованы в огромных количествах на стандартном предметном стекле. Нанолинейки позволяют измерить достижимое пространственное разрешение не только современных микроскопов сверхвысокого разрешения, но также и обычных конфокальных микроскопов. Кроме того, техника ДНК-оригами позволяет изготавливать стандарты яркости с очень четко определенным количеством молекул красителя в пределах одной точки ограниченной дифракцией. Эти стандарты яркости могут использоваться для подсчета абсолютного количества флуоресцентных молекул, особенно в биологических образцах.
Используемая литература:
[1] Raab M. et al.: Chemphyschem 15, 2431–2435 (2014)
[2] Rothemund P. W. K.: Nature 440, 297–302 (2006)
[3] Schmied J. J. et al.: Nat Protoc 9, 1367–1391 (2014)
[4] Klar T. A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8206–8210 (2000)
[5] Gustafsson M. G. L.: Journal of microscopy 198, 82–87 (2000)
[6] Heilemann M. et al.: Angewandte Chemie International Edition 47, 6172–6176 (2008)
[7] Jungmann R. et al.: Nano letters 10, 4756–4761 (2010)
[8] Betzig E. et al.: Science 313, 1642–1645 (2006)
[9] Fölling J. et al.: Nature methods 5, 943–945 (2008)
[10] Schmied J. J. et al.: Nat. Methods 9, 1133–1134 (2012)
