Методы визуализации на конфокальном микроскопе BC43 от Andor

Режимы визуализации

BC43 включает 3 метода визуализации и может использоваться как:

- Конфокальный микроскоп;

- Широкопольный микроскоп;

- Микроскоп проходящего света.

Эти методы визуализации можно комбинировать по мере необходимости в соответствии с требованиями пользователей. Например, может быть чрезвычайно полезно комбинировать конфокальную визуализацию с методом дифференциального фазового контраста (DPC) в проходящем свете для обзора всего образца и тех мест, где флуоресценция локализована в контексте организма.

Многоточечная конфокальная микроскопия

Наиболее важным методом визуализации микроскопа Andor является многоточечная конфокальная визуализация. Благодаря конфокальной визуализации в BC43, Andor предоставляет научному сообществу доступ к трехмерной микроскопии одним щелчком мыши, которая является простой, высококачественной и доступной.

Конфокальная модальность BC43 обеспечивается вращающимся диском с двумя микролинзами, интегрированным с запатентованной Andor системой равномерного освещения Borealis и высокочувствительным научным КМОП детектором.

Точечное отверстие 50 мкм и оптимизированный интервал между отверстиями обеспечивают исключительное подавление фона, в то же время позволяя получать изображения глубоко в толстых образцах. BC43 обеспечивает отличные результаты даже для образцов толщиной более 500 мкм, показано на рисунке ниже.

Камбала, полученная с использованием функции конфокальной микроскопии на BC43

Кроме того, также возможно получение изображений живых образцов большой толщины. BC43 можно легко интегрировать с инкубационной камерой для поддержания правильных условий инкубации (т.е. температуры, влажности и CO2). Например, BC43 использовался для изучения живых образцов рыбок данио. Этот эксперимент был направлен на изучение ангиогенеза у развивающегося эмбриона рыбок данио. Эмбрионы были успешно визуализированы в течение 48 часов без признаков какой-либо фототоксичности или фотообесцвечивания, это подчеркивает, что BC43 отлично подходит для визуализации живых, толстых тканей.

Наконец, BC43 также может передавать конфокальные изображения высокого разрешения со скоростью 15 кадров в секунду в полнокадровом режиме и 44 кадра в секунду при формировании изображений в разрешении 512x512 пикселей.

Развитие сосудов у рыбок данио

Таким образом, конфокальная визуализация в BC43 может использоваться для получения живых или фиксированных образцов и, когда это необходимо, в сочетании с микроскопией в проходящем свете. Кроме того, с помощью конфокальной опции пользователи могут получать изображения до четырех различных флуорохромов.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия

Конфокальная микроскопия не всегда может быть лучшим вариантом визуализации флуоресцентно окрашенных образцов.

Для визуализации живых клеток и особенно для захвата быстрых, динамических событий в тонких и светочувствительных образцах широкое поле может быть более подходящим методом визуализации, чем конфокальный. Принимая это во внимание, Andor включили широкополосную флуоресцентную визуализацию в новый настольный конфокальный прибор BC43.

Кроме того, используя преимущества деконволюции Clear-View™, интегрированной в программное обеспечение Fusion, можно значительно увеличить разрешение широкоугольных изображений. При использовании Clear-View™ характерное размытие широкоугольных изображений будет удалено. Следовательно, это увеличит отношение сигнал / шум изображения и его разрешение. Следует отметить, что адекватно дискретизированное широкопольное изображение, обработанное с помощью деконволюции, может иметь разрешение, сравнимое с конфокальным изображением.

Методика широкопольной визуализации хорошо подходит для длительных исследований живых клеток. В одном исследовании BC43 использовался для получения изображений каждые 8 ​​минут в течение 24 часов. (Клетки находились в среде с контролируемой температурой, но без контроля влажности или CO2.) Результаты показали, что через 24 часа визуализации фотообесцвечивание обнаружить не удалось. После 24 часов визуализации многие клетки начали второй раунд клеточного деления. Это наблюдение указывает на то, что образец не страдал фототоксичностью.

В инкубаторе, контролирующем CO2 и влажность, можно снимать в течение нескольких дней в широкопольном режиме или конфокальном.

Клетки млекопитающих, полученные с помощью BC43, в среде, не зависящей от CO2, в течение 24 часов

Микроскопия в проходящем свете (светлое поле и DPC)

Для микроскопии в проходящем свете пользователь может выбрать два режима визуализации с помощью BC43, это светопольный, и метод, запатентованный Andor, под названием дифференциально фазовый контраст (DPC).

Светопольная микроскопия – самый простой и широко используемый метод в микроскопии проходящего света, оптика и юстировка очень просты. В режиме светлого поля свет проходит через менее плотные области и поглощается более плотными участками образца, создавая контраст. Таким образом, этот метод подходит для образцов с разной степенью плотности. Однако для более тонких образцов и образцов, которые не имеют достаточно больших градиентов плотности (например, однослойные клетки), видимость клеток и даже структур внутри, таких как ядро, становится трудной, поскольку образец будет в значительной степени прозрачным. В этом случае, идеальным выбором будет запатентованный компанией Andor режим дифференциального фазового контраста (DPC).

Сравнение методов визуализации в проходящем свете BC43 в плоских клетках млекопитающих. DPC (дифференциальный фазовый контраст) слева и светлое поле справа.

Для более толстых образцов DPC может предложить преимущество изображения, улучшая изображение с намеком на трехмерную структуру, делая особенности еще более заметными. Тем не менее, нужно иметь в виду, что в некоторых случаях светопольная микроскопия может быть хорошим вариантом для визуализации.

Сравнение методов визуализации в проходящем свете в тканях ландыша. DPC (дифференциальный фазовый контраст) слева и световое поле справа.

Таким образом, для DPC не нужны: специализированные объективы (например, фазоконтрастные объективы), поляризационная оптика (как в DIC), и его можно использовать для получения изображений образцов с двойным лучепреломлением.

Кроме того, DPC обеспечивает стабильную производительность по всей области изображения, при этом она не зависит от настройки углов или поддержания поляризации.

Очень важно, что, в отличие от DIC, изображения DPC можно получать через пластиковые чаши, что практично для многочисленных приложений биологической визуализации.

Для BC43 методы микроскопии в проходящем свете доступны по нескольким щелчкам мыши, поскольку нет необходимости в пользовательской настройке ни в светлом поле, ни в DPC. С BC43 пользователю не нужно настраивать освещение Колера или выравнивать фазовую пластину / фазовое кольцо.

Применения BC43

Приложения BC43 для получения изображений неразрывно связаны с методами и технологиями, которые позволяет использовать это оборудование. Как видно из таблицы ниже, с BC43 можно использовать несколько методов визуализации, позволяющих использовать их во многих различных приложениях.

Технология и методы визуализации BC43:

Учитывая широкий спектр возможностей визуализации BC43, вот небольшая подборка примеров, в которые BC43 показывает себя особенно хорошо:

- Клетки млекопитающих;

- Стволовые клетки;

- Области тканей;

- Малые органы (например, слюнные железы);

- Яичная камера дрозофилы;

- Эмбрион дрозофилы;

- Сомиты куриные;

- Данио;

- Камбала;

- Дафния.

Образцы модельных организмов могут быть отображены вживую или зафиксированы в зависимости от биологической важности. В одном образце можно использовать до четырех различных флуорохромов. Кроме того, при необходимости методы визуализации в проходящем свете можно легко комбинировать с конфокальной или широкопольной микроскопией.

Некоторые примеры приложений для обработки изображений:

- Живой ангиогенез у рыбок данио;

- Клеточный цикл в клетках млекопитающих;

- Быстропротекающие процессы, такие как отслеживание плюсовых концов микротрубочек;

- Фиксированный нейронный мозг рыбок данио (визуализация толщиной более 400 мкм);

- Фиксированная камбала (толщиной более 500 мкм).

Система BC43 исключительно универсальна и способна обеспечивать выдающиеся результаты во множестве различных приложений и в широком диапазоне организмов способами, которые невозможны на других системах визуализации.