Представленная инновационная технология была разработана доктором Фредериком Брау из центра MICA (Microscopy Imagerie Côte d'Azur) и Института молекулярной и клеточной фармакологии (IPMC) в сотрудничестве с П. Жираром и Н. Моклером из Обсерватории Ниццы (Франция); при финансовой поддержке GIS IBiSA (План ITMO по борьбе с раком 2009-2013). В настоящее время система интегрирована с решением Inscoper Imaging Solution для оптимизации последовательностей получения изображений и облегчения их использования биологами.
Преимущества флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения для 3d визуализации
Ткани состоят из множества поляризованных типов клеток, организованных в четко определенную трехмерную архитектуру. Визуализация больших образцов стала необходимой техникой для характеристики биологических процессов (таких как физиологическое или патологическое развитие тканей/органов) и анатомических структур (васкуляризация, иннервация, ...). Основные трудности визуализации больших образцов заключаются в неоднородности показателя преломления и состава тканей, которые ограничивают пространственное разрешение и глубину визуализации (Wang et al, 2014). Однако для обхода этих проблем было разработано большое разнообразие методов очистки (Richardson & Lichtman, 2015).
Открытое в 1902 году, использование плоскостного освещения в микроскопии было затем объединено с флуоресцентной микроскопией для биологических приложений (Siedentopf & Zsigmondy, 1902; Voie et al, 1993). Лазерный луч латерально освещает образец тонким световым листом в фокальной плоскости, а излучаемая флуоресценция затем собирается перпендикулярно камерой.
Флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения (LSFM) в настоящее время является идеальным методом для визуализации очищенных образцов (Huisken et al, 2004). Она имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной оптической секционной микроскопией. Это система на основе камеры, обеспечивающая лучшую чувствительность для обнаружения фотонов. Такой подход также обеспечивает большую скорость получения изображения благодаря отсутствию сканирования, что ограничивает фототоксичность. Таким образом, LSFM предоставляет исследователям мощный подход для получения изображений флуоресценции (эндогенной или иммуномеченой) широкого спектра биологических образцов, от органоидов до очищенных органов или целых тел мышей.
Модернизация макроскопа до ультрамакроскопа
Команда Фредерика Брау (Институт молекулярной и клеточной фармакологии [IPMC]; Ницца, Франция) недавно разработала открытый и универсальный модуль освещения световыми листами, который может быть легко внедрен в коммерческие макроскопы (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss). Эта система состоит из сдвоенного осветительного блока на основе цилиндрических линз (рис. 1). Ультрамакроскоп, используемый в данной статье, был представлен на семинаре в рамках MiFoBio 2021 (Жиенс, Франция). Он основан на макроскопе (MVX10; Olympus, Токио, Япония). Имеются два осветительных блока, расположенных друг напротив друга, оба они соединены с лазерным источником (LBX-4C; Oxxius, Lannion, Франция) индивидуальным оптическим волокном. Для предотвращения хроматической аберрации лучи проходят через двойной ахроматический дублет (AC254-075-A-ML; Thorlabs, Ньютон, США). Затем параллельный пучок проецируется на цилиндрический дублет (ACY254-100-A, Thorlabs) через ирисовую диафрагму, чтобы вызвать образование двух световых листов, обращенных друг к другу. Фокусировка и выравнивание световых листов осуществляется путем перевода и наклона осветительного блока. Точное выравнивание листов можно осуществить с помощью призмы с ножевой кромкой (KRPB4-15-550; Optosigma Europe, Les Ulis, Франция). Ортогональный вид листов света 488 нм и 561 нм при различных положениях призмы указывает на качество выравнивания. Держатель образца расположен в точке пересечения лучей и может использоваться для перемещения биологического образца по вертикали с помощью вертикального транслятора (M-122.2DD; Physik Instrumente, Карлсруэ, Германия). Излучаемый флуоресцентный сигнал собирается через объектив 2X/0,5, колесо фильтров (Lambda 10-B; Sutter Instrument, Novato, CA, США) и фиксируется камерой sCMOS (Flash4.0; Hamamatsu, Hamamatsu, Япония).
Рисунок 1: Установка ультрамакроскопа, оснащенная Inscoper Imaging Solution
Эта система изначально управлялась с помощью программного обеспечения μManager и упоминалась в нескольких публикациях (Simon et al, 2017; Guyot et al, 2019a, 2019b). Однако недостаточная эргономичность программного обеспечения делала работу пользователя утомительной. Исследовательская группа решила перейти на решение Inscoper Imaging Solution, чтобы все устройства были интегрированы и управлялись в удобной для пользователя среде. Изображения генерируются в открытом формате, совместимом с программным обеспечением для 3D-визуализации и рабочим процессом анализа.
Решение Inscoper Imaging Solution для самодельных систем визуализации
Inscoper Imaging Solution - это комплексное решение для получения изображений для базовых и продвинутых микроскопов на основе камер, используемых в биологических науках. Оно может использоваться как в коммерческих (Leica, Nikon, Olympus и Zeiss), так и в самодельных системах для интеграции нового устройства (камеры, источника света, модуля вращающегося диска, ...) или полной модернизации системы. В любой ситуации удобный графический интерфейс пользователя позволяет полностью контролировать все моторизованные устройства, настраивать протоколы калибровки, получать многомерные данные (время, XYZ, каналы, мультипозиции и мозаика) и визуализировать. В дополнение к своей универсальности и эргономичности, технология Inscoper улучшает временное разрешение съемки, устраняя все программные задержки и оптимизируя синхронизацию элементов микроскопа (рис. 2).
Рисунок 2: Пользовательский интерфейс программного обеспечения Inscoper
Обзор пользовательского интерфейса Inscoper, используемого для управления многомерной визуализацией на самодельном ультрамакроскопе, включая таймлапс, Z-стек и многоканальные съемки. Все эти измерения полностью настраиваются, чтобы быть более подходящими для экспериментов пользователя. Программное обеспечение также предоставляет пользователям специальный протокол калибровки для выполнения совместного выравнивания обоих световых листов перед получением изображения.
Биологические применения
Ультрамакроскоп, оснащенный системой Inscoper Imaging Solution, был продемонстрирован во время мероприятия MiFoBio 2021 (Жиенс, Франция) на семинаре "Иммунолабирование и очистка тканей, приобретение с помощью самодельной и коммерческой системы", который провели Софи Абелане (Институт молекулярной и клеточной фармакологии [IPMC]; Ницца, Франция) и д-р Хлоя Доминичи (Институт исследований рака и старения [IRCAN], Ницца, Франция).
Система использовалась для получения изображения всей молочной железы мыши (размеры: 1,5×0,5 см). Этот орган был подготовлен с использованием протокола очистки iDISCO+. Этот протокол был выбран за его совместимость с иммуномечением, простоту и низкую стоимость (Renier et al, 2016). Он также был иммуномечен первичным антителом против SMA (Smooth Muscle Actin) и вторичным антителом, соединенным с Alexa 568. Белок SMA маркирует миоэпителиальные клетки в молочной железе. Эти дифференцированные клетки образуют базальный слой млечных протоков, прилегающий к подкладочной мембране. Миоэпителиальные клетки выполняют различные функции, включая сокращение для выведения секретов железы (Gieniec & Davis, 2022). Маркировка этого белка часто используется для характеристики структуры всей ткани и оценки влияния патологического явления.
С помощью ультрамакроскопа удалось получить изображение всего органа (рис. 3). Затем изображения, полученные с помощью Inscoper Imaging Solution, были открыты с помощью программного бесплатного обеспечения ImageJ для обработки и коммерческого программного обеспечения Imaris (Bitplane, Белфаст, Великобритания) для 3D визуализации образца.
Рисунок 3. Визуализация миоэпителиальных клеток в очищенной молочной железе с помощью ультрамакроскопа
Максимально проекционное изображение всей очищенной iDISCO молочной железы с маркировкой миоэпителиальных клеток (SMA, красный). Два пунктирных прямоугольника увеличены в правой части изображения. Пунктирные круги представляют некоторые скопления альвеол, а стрелки указывают на протоки. Масштабная линейка: 1 мм (слева) и 500 мкм (справа).
Выводы
Микроскопия на кастомных микроскопах, описанная в данной статье, позволила инновационно и экономически эффективно модернизировать ранее существовавшую систему в ультрамакроскоп. Компания INSCOPER предоставила индивидуальное решение для улучшения пользовательского опыта и управления микроскопом. Решение Inscoper Imaging Solution гарантирует идеальную синхронизацию всех устройств системы и удобство работы с изображениями благодаря интуитивно понятному и надежному программному интерфейсу. Такая система может использоваться в широком спектре приложений, включая онкологию, исследования развития, биораспределение меченых молекул или характеристику биологических структур (нервная система, кровеносные и/или лимфатические сосуды, ...).
