Дендриты и дендритные шипики состоят из тонких, слабых и уязвимых отростков, поэтому их трудно изучать. Однако, используя двухфотонную лазерную микроскопию, мы можем собирать сигналы от фемтолитровых объемов более глубоких областей мозга, одновременно избегая фототоксических реакций. Кроме того, пространственно ограниченное сканирование аксонов, дендритов и шипиков в областях интереса позволяет обнаруживать даже подпороговые сигналы с высоким отношением сигнал/шум.
|
|
|
Микроскоп FEMTO3D Atlas от Femtonics
Микроскоп FEMTO3D Atlas позволяет разделять события с разницей менее чем в миллисекунду, и, следовательно, скорость распространения регенеративной активности определяется на нескольких участках дендритной ветви. Режим произвольного трехмерного сканирования и его расширенные версии поддерживают все виды функционального дендритного сканирования.
На видео показана трехмерная запись сигналов Ca2+ в нескольких участках дендритов с помощью трехмерного сканирования произвольных точек. Подробнее см. в Chiovini et al., Neuron, 2014.
Быстрое смещение вдоль дендрита
Режим анализа: 3D Trajectory
Произвольное трехмерное сканирование, расширенное за счет смещения фокальной точки по коротким трехмерным траекториям, позволяет получать изображения без прерывания на нескольких длинных дендритных ветвях. Во время смещения процесс анализа непрерывен, поэтому данный режим сканирования дает более детальное пространственное разрешение без изменения общего времени сканирования, которое сопоставимо с тем, что и при обычном точечном сканировании. В результате может быть выявлена функция тонких дендритных сегментов или даже дендритных шипиков. Подробнее: Katona et al., Nat Meth, 2012, Chiovini et al., Neuron, 2014.
Сбор информации о сотнях шипиках нейрона in vivo
Режим анализа: 3D Multiple-line
Режим многострочного сканирования 3D Multiple-line аналогичен режиму сканирования по трехмерной траектории 3D Trajectory, однако он был разработан для сканирования шипиков во время движения. Благодаря сканированию вдоль коротких линий, шипики все еще находятся в их пределах, даже если животное движется. Каждая линия сканирования связана с одним шипиком в пирамидальной клетке слоя II/III, меченной GCaMP6. Направление смещения устанавливается таким образом, чтобы следовать усредненным траекториям, рассчитанным по движению мозга, что помогает устранить артефакты передвижения. В общей сложности одновременно были исследованы 100 предварительно выбранных шипиков, и четыре соответствующих переходных процессов Ca2+ показаны до и после коррекции движения, демонстрируя улучшение отношения сигнал/шум. Подробнее: Szalay et al., Neuron, 2016.
Измерение дендритной и шипиковой активности во время малых движений
Режим анализа: 3D Ribbon scanning
Расширением режима многострочного сканирования, выполняемого с использованием технологии коррекции движения, является режим 3D Ribbon scanning, который позволяет отображать лентообразные поверхности, включающие в себя дендриты и соседние области. Ниже представлены трехмерные ленты, охватывающие семь дендритных сегментов с шипиками из пирамидального II/III слоя нейрона, меченного с помощью GCaMP6, измеренного в головном мозге живой мыши. Семь измеренных лент были спроецированы в 2D-изображения дендритов, располагающиеся друг над другом для лучшей визуализации. Активность была записана с 40 отобранных шипиков и визуализирована в форме классических переходных процессов Ca2+. Подробнее: Szalay et al., Neuron, 2016.
Измерение дендритной и шипиковой активности во время крупных движений
Режим анализа: 3D Snake scanning с использованием трехмерной коррекции движения
Режим сканирования 3D Snake scanning является трехмерным расширением режима 3D Ribbon scanning и заключает в себе всю окружающую среду дендрита во время измерения. Поэтому он позволяет проводить сканирование дендритов у более крупных животных или анализ поведенческих алгоритмов, в которых амплитуда движения может быть большой. На рисунке ниже представлено быстрое сканирование в данном режиме, выполненное при 10 Гц, в выбранной дендритной области пирамидального нейрона V1. Подробнее: Szalay et al., Neuron, 2016.
Быстрое сканирование длинных дендритов
Высокоскоростное произвольное сканирование кадров дает вам свободу наклона и поворота плоскости сканирования в любом направлении. С помощью этой функции визуализацию длинных дендритов in vivo можно выполнять в одной плоскости. Для одновременного изучения апикальных дендритов нескольких нейронов наклонную рамку можно расширить до элемента объема. Видео показывает, как апикальные дендриты нейронов выравниваются с плоскостью сканирования, а это означает, что пространственно-временные паттерны активности этих длинных сегментов, проходящих через несколько слоев коры, могут быть записаны без необходимости длительных и кропотливых оптических срезов.
