Система освещения iLas 2

- Вращающаяся TIRF микроскопия и быстрая угловая моторизация;

- Одновременная многоволновая TIRF микроскопия с адаптацией глубины проникновения;

- Непревзойденная равномерность освещения.

Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) является идеальной техникой для наблюдения клеток, близко расположенных к поверхности покровного стекла, поскольку это обеспечивает максимально возможное осевое разрешение (от 60 до 300 нм в зависимости от угла падения освещения). Этот метод охватывает большую область применений, таких как отслеживание одной молекулы, визуализация процессов секреции, взаимодействие клеток.

Рис. 4. Двойная трансфекция стабильной клеточной линии M10 (Langerine-YFP зеленого цвета; mCherry-Rab11A красного цвета). Изображения были получены со скоростью визуализации 10 кадров в секунду, 100 мс экспозиция в потоковом режиме с использованием делителя изображения для одновременного обнаружения двух флуоресценций в TIRF микроскопии.

Рис. 5. 3D TIRF-визуализация актиновой сборки in vitro на скудных узорах покровного стекла. Структуры кажутся довольно неорганизованными и простираются в направлении Z. Миниатюрная вкладка показывает клеточные нити, пересекающиеся с разрывом 150 нм.

Рис. 6. Однотрансфицированные M10 стабильные клетки (mCherry-Rab11A) в сверхбыстром TIRF/широкопольном эксперименте. Изображения были получены при скорости 10 кадров в секунду, время экспозиции 100 мс (для 2 минут, 600 кадров), потоковое время и глубина проникновения (TIRF/широкопольная). Сверхбыстрое двойное изображение позволяет увидеть одиночные везикулы в плазматической мембране (TIRF) с их движением внутри тела клетки.

Рис. 7. In-vitro полимеризация актина. Рост актиновой нити начинается с продольного микро-шаблона, функционирующего с активатором нуклеации. Изображения были получены при скорости в 1 кадр каждые 10 секунд в TIRF освещении. TIRF необходим для того, чтобы удалить высокий фон актиновых мономеров в растворе. Были проведены FRAP эксперименты по исследованию полярности нитей и механизма роста из навязанной нуклеации.

- Гальванический / векторный режим работы с частотой 20 кГц;

- Моментальная фотопертурбация;

- Алгоритм автокалибровки;

- Быстрое многозонное / точечное лазерное воздействие.

Методы локализованного лазерного воздействия такие как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP, FLIP), фотоактивация, uncaging, фотоабляция, представляют собой очень мощные инструменты для фотоманипуляции тканями или анализа внутриклеточной динамики белков и других макромолекулярных комплексов. Например, FRAP допускает возмущение устойчивого распределения флуоресценции с помощью фотообесцвечивающей флуоресценции в избранных областях. После этапа отбеливания исследователи могут наблюдать и анализировать, как распределение флуоресценции возвращается к тому же или другому устойчивому состоянию, давая оценку пространственно-временному периоду полураспада интересующей молекулы в одном конкретном месте живого образца. Фотоактивация или фотопреобразование использует фотоконвертируемые флуорофоры, позволяющие проводить морфологические эксперименты типа «pulse and chase».

Система освещения iLas 2 предоставляет легкий в использовании интерфейс для управления лазерами, настройкой области интереса ROI и планирование эксперимента. Чтобы упростить процесс визуализации и повысить скорость вращения лазерного луча, система освещения iLas2 управляется собственной электроникой. Векторный режим сканирования и режим реального времени предоставляют возможность измерить быстрые процессы. Пользователь может фотообесцвечивать быстро движущиеся структуры, проанализировать их восстановление и отследить как они продолжают двигаться с помощью алгоритма слежения.

Рис. 8. Экспрессирующие клетки HeLA (клатриновая цепь mRFP-LCa). Изображения были получены в TIRF освещении (экспозиция 100 мс). Клатрин накапливается на плазматической мембране в покрытых клатрином ямах. Несколько одноточечных областей интереса ROI были обесцвечены сразу, чтобы включить несколько количественных определений. Двухшаговая последовательность после фотообесцвечивания была получена для того, чтобы получить компромисс между хорошей точностью на t1 /2 и слабо наблюдаемым фотообесцвечиванием (4 кадра в секунду, затем 0,25 кадра в секунду).

Рис. 9. 2D+t и 3D+ t FRAP широкополосные последовательности визуализации и связанные с ними кривые перераспределения. Во всех случаях весь Golgiapparatus (объем интереса) был подвержен лазерному облучению. А) GFP-димеклин (2D+t, кривая 1), B) GFP-Rab6A (3D+t, кривая 3) и C) PA-GFPRab6A (3D+t, кривая 2). Все кривые восстановления показывают среднюю интенсивность в течение времени в объеме аппарата Гольджи.

- Низкий фон;

- Требуется меньшее освещение;

- Оптическое секционирование близко к покровному стеклу;

- Нет необходимости в широкопольном источнике света.

В дополнение к другим возможностям, система освещения iLas 2 позволяет пользователям проводить широкопольную съемку, используя преимущества наклонного освещения, чтобы уменьшить размытие фона, которое возникает из несфокусированных плоскостей, и усилить освещение возбуждения (темнопольное лазерное освещение). В результате, пользователи получают высокое качество изображения с меньшей мощностью возбуждения с меньшим фотообесцвечиванием или более быстрые скорости визуализации. Секционирование с наклонной подсветкой является продолжением темнопольного лазерного освещения. Для больших углов падения, но менее чем критический угол падения, начало доминирования TIRF освещения возникает тогда, когда угол лазерного пучка возбуждения, проходящего через образец настолько большой, что освещенная толщина ткани очень тонкая (около 2 мкм).

Рис. 10. Широкопольные изображения живых клеток M10, экспрессирующих YFPLangerine. Левое изображение было подсвечено перпендикулярным лазерным освещением. Правое изображение было подсвечено наклонным освещением на 50° градусов, используя те же настройки мощности освещения и сбора данных. Фон пошел вниз от 157 до 76 уровней серого (область белого квадрата).

- Возможности TIRF или широкопольного освещения;

- Нижний фон для лучшего обнаружения событий;

- Удаление артефактов из-за неравномерности поля освещения.

Микроскопия обнаружения и отслеживания одной молекулы представляют собой очень сложные методы. Оба требуют высокой производительности визуализации и лазерного возбуждения превосходного оптического качества. Система освещения iLas 2 обеспечивает способность производить широкопольное лазерное освещение (широкопольное, наклонное или TIRF освещение), и при этом она значительно улучшает равномерность освещения. Таким образом способность возбуждать и обнаруживать не модулируется случайными шаблонами и отсутствуют артефакты, возникающие на реконструированных изображениях со сверхвысоким разрешением.

Рис. 11. Трехмерное изображение микротрубочек в ячейке MEF со сверхвысоким разрешением, полученное с использованием метода DNA-PAINT.