Вступление
Конфокальная микроскопия широко применяется в лабораториях и помогает ученым делать новые открытия. Тем не менее этот метод имеет определенные ограничения, касающиеся оптического разрешения и чувствительности. С одной стороны, разрешение зависит от дифракционного предела и, следовательно, субклеточные компоненты или микроорганизмы не могут быть различимы. С другой стороны, чувствительность наиболее распространенных конфокальных фотодетекторов, таких как фотоэлектронные умножители, относительно невысокая. Во многих приложениях программная деконволюция используется для дальнейшего улучшения разрешения, но получаемые результаты неоптимальны, когда изображение имеет шум и низкую контрастность.
В этой статье мы демонстрируем, что технология RCM позволяет получить конфокальные изображения с более высоким оптическим разрешением и контрастом, чем конфокальные системы на основе фотоумножителей, что приводит к получению гораздо лучших результатов, особенно при использовании методов деконволюции.
Полученные результаты
Оптический RCM модуль для конфокальной микроскопии генерирует изображения с более высоким разрешением и контрастом, чем традиционные конфокальные системы.
Синаптонемный комплекс представляет собой крупную белковую комплексную структуру, присутствующую в сперматоцитах, которая удерживает вместе гомологичные хромосомы во время мейоза. Визуализация этой структуры затруднена из-за короткого расстояния между хроматидами, которое находится вне дифракционного предела.
Рисунок 1. Сравнение изображений синаптонемного комплекса полученных с помощью стандартного конфокального микроскопа и оптического модуля RCM.
Сперматоциты мыши, окрашенные флуорофором SYCP3 (Alexa-488) были получены с использованием стандартного конфокального микроскопа с фотоумножителями с рекомендуемой апертурой точечного отверстия в 1 AU (AU – Airy Unit, единица Эйри) (рис. 1А). В этом случае разрешение не было достаточным, чтобы правильно различить хромосомы. Для улучшения разрешения точечное отверстие было закрыто до 0.3 AU (рис. 1B), что позволило достигнуть 170 нм. Закрытие точечного отверстия означает, что на детектор попадает меньше испускаемого красителем света и контраст изображения становится ниже. Интенсивность излучения лазера была увеличена, чтобы компенсировать потерю испускаемого света, но это также привело к повышению шума (рис. 1B) (Таблица 1). Необработанные изображения, полученные с помощью оптического модуля RCM, показали лучшие результаты, достигнув оптическое разрешение 170 нм и более высокое отношение сигнал/шум по сравнению с конфокальными изображениями полученными на системе на основе фотоуможнителей (рис. 1C).
Особенности фона, наблюдаемые на рис. 1B были потеряны при использовании оптического модуля RCM (Рис. 1C) и меньшая интенсивность лазера требовалась для получения изображения с высокой контрастностью (таблица 1).
Высококонтрастные изображения оптического модуля RCM позволяют получить оптимальную деконволюцию
Чтобы различить структуру синаптонемного комплекса сперматоцитов проводилась деконволюция в 3-х необработанных изображениях, показанных на рис. 1A, B и C. Только на конфокальных изображениях полученных с помощью оптического модуля RCM деконволюция структуры синаптонемного комплекса была правильно дифференцирована (рис. 1 D, E, F). Расстояние между хроматидами составило 120 нм (рис. 2).
Левая часть рисунка показывает изображение исследуемого образца. Изображения A, B и C представляют собой необработанные изображения, полученные из одной и той же области в образце с использованием указанных конфокальных систем и условий визуализации. Изображения D, E и F показывают одинаковые изображения после выполнения деконволюции с рассчитанной функцией рассеяния точки PSF. Шкала 1 мкм.
Таблица 1. Интенсивность излучения лазера в плоскости образца. Мощность лазера, измеренная с помощью измерителя мощности лазерного излучения Thorlabs S170C в трех различных экспериментальных условиях.
|
Конфокальная система 1.0 AU |
Конфокальная система 0.3 AU |
Оптический модуль RCM |
|
4.29 мкВт |
12.5 мкВт |
3.0 мкВт |
Материалы и методы
Подготовка хромосом фиксированных сперматоцитов мыши были любезно предоставлены А. Агостиньо (Advanced Light Microscopy Facility, Лаборатория науки для жизни). Образцы были окрашены на SYCP3 и помечены Alexa-488. Хромосомы были визуализированы с помощью оптического модуля RCM1 присоединенного к микроскопу Nikon TiE с использованием масляного объектива Plan Apo 1,45NA (Nikon Instruments). Сигнал регистрировался с помощью оптического модуля RCM1 и камеры Hamamatsu Orca Flash 4 V3.
Обычная конфокальная визуализация выполнялась на конфокальном микроскопе на основе фотоумножителей. Детектор HyD использовался для получения более высокой квантовой эффективности. Уровень масштабирования был установлен таким образом, чтобы получить размер пикселя 43 нм в плоскости изображения (такой как в RCM) и z-стек был сделан с интервалом между срезами 150 нм для правильной деконволюции.
Мощность лазера измерялась с помощью измерителя Thorlabs S170C с использованием масляной иммерсии для захвата всех световых лучей. Все изображения были обработаны методом деконволюции с использованием программного обеспечения SVI Huygens с измеренной функцией рассеяния точки. Обработанное деконволюцией изображение полученное с помощью оптического модуля RCM продемонстрировало разрешение 120 нм, что позволило правильно различить синаптонемный комплекс.
Рисунок 2. График, показывающий расстояние между хроматидами, измеренное на изображении 1F.
Выводы
Эти результаты показывают, что оптический модуль RCM имеет более высокое разрешение и чувствительность по сравнению с традиционными конфокальными системами и позволяет использовать меньшую мощность лазера для достижения лучших результатов. Благодаря шагу повторного сканирования получаемое разрешение улучшается на 40% без закрытия точечного отверстия. Точечное отверстие в оптическом модуле RCM составляет 1.2 AU, что означает, что больше испускаемого образцом света проходит через него.
В отличие от других конфокальных сканирующих микроскопов оптический модуль RCM использует самый чувствительный детектор из доступных на сегодняшний день на рынке – научную камеру на основе sCMOS сенсора. Это приводит к достижению более высокой чувствительности и повышению соотношения сигнал/шум в необработанном изображении. Высокая чувствительность оптического модуля RCM позволяет снизить мощность лазера до минимума, уменьшив фотообесцвечивание флуорофоров и фототоксичность.
Алгоритмы деконволюции чувствительны к избыточному шуму на получаемом изображении. Таким образом, мы не смогли различить ультратонкие структуры синаптонемного комплекса после деконволюции изображения на рис. 1B (конфокальное изображение 0.30 AU). Однако несмотря на такое же исходное разрешение деконволюция изображения полученного с помощью оптического модуля RCM показала, что структура синаптонемного комплекса хорошо различима благодаря гораздо более высокому контрасту необработанного изображения.
Технология RCM открывает дверь в получение изображений микроскопии сверхвысокого разрешения с низкой мощностью лазера и высокой чувствительностью. Визуализация живых клеток это область, которая получит наибольшую пользу от этого сочетания, поскольку клетки чувствительны к фототоксичности.
Ссылки:
Giulia MR de Luca, Ronald MP Breedijk, Rick AJ Brandt, Christiaan HC Zeelenberg, Babette E de Jong, Wendy Timmermans, Leila Nahidi Azar, Ron A Hoebe, Sjoerd Stallinga and Erik MM Manders. “Re-scan confocal microscopy: scanning twice for better resolution”. Biomed Opt Express 2013. DOI 10.1364/BOE.4.002644
