Арт. STEDYCON
Несмотря на все разговоры о критериях и определениях, измерение разрешения микроскопа более тонкий момент, чем вы думаете. Масштабы, на которых сегодня работают микроскопы, подвержены шуму и фону, которые затемняют и искажают сигналы. То, что вы используете для измерения, может иметь большое значение.
Определение крошечного расстояния в море шума
Разрешающая способность микроскопа — это его способность различать две точки в образце. Стандартные критерии приравнивают разрешение к ширине функции рассеяния точки (PSF), которая размывает детали на изображениях. С практической точки зрения, эти измерения выполняются на профиле интенсивности PSF точки, беря полную ширину на половине максимума пика или FWHM (рис. 1)1. Однако современные микроскопы достигают беспрецедентного уровня разрешения. В этих масштабах изменчивость является доминирующей силой, и это влияет на то, как мы измеряем разрешение.
Рисунок 1. Приблизительное разрешение, основанное на полной ширине на полувысоте (FWHM) профиля интенсивности PSF.
1Учитывая, что разрешение заключается в разделении двух точек, почему достаточно измерить PSF одной точки, а не двух? Визуализация с помощью микроскопа представляет собой линейную операцию. Процесс отображения одной точки не зависит от других точек образца. Таким образом, если мы знаем PSF одной точки, мы знаем PSF любой другой точки.
Шум
FWHM является хорошим приближением к разрешению, особенно когда отображаемая точка значительно меньше, чем PSF, и сигнал этой точки значительно перевешивает шум и фон. Но при высоком разрешении ни одно из условий не выполняется. По мере увеличения разрешения вам приходится работать со все более мелкими точками, что в случае флуоресценции приводит к заведомо слабым сигналам, которые трудно отличить от фона. На самом деле, поток фотонов, регистрируемый микроскопами сверхвысокого разрешения, омывается морем изменчивости, которая искажает сам сигнал и затрудняет измерения. Есть шум от инструментов и есть фон, такой как флуоресценция от оптических компонентов и от молекул за пределами интересующей плоскости. Также присутствует шум от стохастических флуктуаций при обнаружении фотонов, который искажает профили интенсивности PSF. В высоком разрешении измерения сильно зашумлены. Таким образом, измерения становятся задачей минимизации изменчивости.
Воспроизводимость
Давайте проведем мысленный эксперимент: вы изображаете случайное распределение флуоресцентных точек для измерения разрешения микроскопа. Три параметра вашей выборки играют роль в вашем измерении: расстояния между случайно распределенными точками, размер PSF, который отбрасывает каждая точка, и яркость каждой точки. Почему? Потому что все они могут внести изменчивость в ваши измерения. В зависимости от того, насколько близко они расположены друг к другу, флуоресцентные красители могут влиять на излучение друг друга (например, тушение) и, следовательно, изменять размер и форму PSF. Различия между измеренными PSF — например, из-за различий в размерах точек — снижают воспроизводимость измерений. И последнее, но не менее важное: тусклые флуоресцентные точки излучают меньше фотонов, что делает профили интенсивности PSF более уязвимыми для искажения из-за шума детектирования. Чтобы получить идеально точные измерения разрешения, вам следует контролировать эти параметры.
Идем дальше. Прекратите мысленный эксперимент и выбросьте образец, который вы использовали. Теперь возьмите стандартизированный флуоресцентный краситель, состоящий из зондов, которые хорошо воспроизводимы по размеру, форме, яркости и расстоянию друг от друга. Эти «стандартные зонды» должны быть небольшими, чтобы то, что вы измеряете, было в максимально возможной степени просто PSF. Стандартные зонды также должны быть яркими — излучать много фотонов — чтобы преодолеть шум обнаружения и генерировать надежные профили интенсивности PSF.
Хорошо. Давайте использовать эти стандартные зонды, скажете вы. Но это не так просто. Правда в том, что ни одному из используемых в настоящее время стандартов не удается смягчить изменчивость всех трех параметров. В таблице 1 перечислены стандартные типы зондов, используемые для определения разрешения. Каждый из них имеет особенности, которые делают его более подходящим для определенных, но не для всех систем микроскопии.
Таблица 1. Стандартный тип зонда, используемый для измерения разрешения микроскопа
При высоком разрешении точечные излучатели, такие как отдельные молекулы, являются неоптимальным стандартом. Они излучают слабый флуоресцентный сигнал, который может быть скрыт фоном и шумом. Они случайным образом переключаются между яркими и темными состояниями — что-то, называемое прерывистостью флуоресценции или миганием, — и на их излучение влияет ориентация их диполей. В совокупности это означает, что интенсивность излучения точечного излучателя, как правило, невоспроизводима, что делает измерения разрешения ненадежными. Давайте рассмотрим две альтернативы.
Альтернативный вариант: увеличить размер
Один из вариантов состоит в том, чтобы найти что-то немного большее, чем точечные излучатели: использовать флуоресцентную бусину известного размера, который меньше разрешения микроскопа. Эти шарики строго стандартизированы и заполнены молекулами красителя, которые вместе излучают досочно сильный сигнал для хорошего отношения сигнал/шум. Сферическая форма шарика и большое количество излучателей также устраняют любые эффекты ориентации. Наконец, размер шариков удерживается в узком диапазоне диаметров, и, таким образом, этот стандартный тип зонда генерирует высокостабильную PSF. Это преимущества.
Неудобством, пожалуй, является именно такой размер. Поскольку шарик имеет диаметр, его изображение PSF представляет собой составную часть (свертку) самого шарика и эффективного PSF микроскопа (рис. 2). Мы можем измерить FWHM изображения PSF. Однако именно FWHM эффективной PSF дает нам разрешение микроскопа. Это означает, что мы должны вычислить ширину эффективной PSF из PSF изображения с учетом размера шарика.
Рисунок 2. Эффективная PSF равна PSF изображения с маленькой бусиной. Его также можно рассчитать по изображению PSF, когда известны размеры большего шарика.
К счастью, этот расчет был разработан для STED. В случаях, когда шарик намного меньше, чем эффективная PSF, влиянием размера шарика можно пренебречь. То есть FWHM изображения PSF является разрешением микроскопа. Однако в случаях, когда размер шарика сравним с эффективной PSF, вклад диаметра шарика в PSF изображения становится более доминирующим. Но мы знаем размер шарика! Имея эту информацию, мы можем рассчитать истинное разрешение.2
2Harke, B. 2008. 3D STED microscopy with pulsed and continuous wave lasers. Dissertation thesis. University of Göttingen.
Альтернатива вторая: помните о расстоянии
Другой вариант — поддерживать постоянным расстояние между стандартными зондами. Для этого ваш стандарт требует структуры — чего-то, что удерживает два флуоресцентных зонда на фиксированном расстоянии друг от друга. Поддержание такого рода трехмерных отношений между точками оказывается полезной особенностью ДНК-оригами. Подобно бумаге, ДНК-оригами складывается в наноструктуры и может включать в себя дискретные места связывания для флуоресцентных молекул, расположенные в запрограммированной геометрии. Таким образом, можно создавать стержни с флуоресцентными зондами на фиксированном, известном расстоянии друг от друга.
Рисунок 3. В ДНК-оригами ДНК складывается в запрограммированную геометрию, которая удерживает флуоресцентные участки мечения на заранее определенном расстоянии друг от друга.
Фиксированное расстояние между каждой парой флуоресцентных зондов обеспечивает дополнительную точку отсчета для оценки разрешения микроскопа. Таким образом, вы знаете характеристику вашего образца, которую можно найти на изображении микроскопа для оценки точности. В этом смысле этот стандартный тип зондов дает больше информации о производительности системы, чем размер PSF. Однако (и всегда есть недостаток) работать с ДНК-оригами сложно. Кроме того, тусклая флуоресценция приводит к низкому соотношению сигнал/шум, а тушение между соседними зондами еще больше искажает результаты измерений.
Молекула против производительности микроскопа
Использование флуоресцентных бусин или ДНК-оригами для измерения разрешения - это не вариант для всех систем микроскопов. Их ограничения по трем характеристикам, которые мы обсуждали, особенно важны для систем сверхразрешения, где поведение флуоресцентных молекул является неотъемлемой частью достижения субдифракционного разрешения. Другими словами, если сверхразрешение возникает в результате взаимодействия микроскопа и молекулы, то как отличить производительность микроскопа от производительности молекулы при измерении разрешения?
Для STED эта двойственность менее проблематична, чем для других технологий сверхразрешения. STED достигает субдифракционного разрешения, ограничивая область, где флуоресцентная молекула может испускать фотоны, диаметром около 20 нм. То есть, разрешение является ограничением до тех пор, пока вы используете яркий зонд, который меньше разрешения.3 Но рассмотрим микроскопию локализации одиночных молекул. Там сверхразрешение достигается за счет вычисления координат флуоресцентных молекул. Точность этой локализации зависит от анализа последовательных, надежных PSF редко распределенных флуоресцентных зондов. Звучит знакомо? PSF. Высокая эмиссия фотонов. Расстояние. Три парамтра из трех, которые нынешние стандартные типы зондов просто не могут выполнить. На самом деле, разрешение SMLM-систем часто измеряется с помощью кольцевой корреляции Фурье (FRC), которая позволяет полностью отказаться от измерения FWHM PSF.
По мере того, как микроскопия сверхразрешения продвигается все дальше в субнанометровые масштабы, взаимодействие микроскоп-молекула становится все более важным для производительности. Прорыв произойдет не только благодаря творческому подходу к разработке микроскопов, но и благодаря оптимизации химии красителей. Это - следующий рубеж в технологиях сверхразрешения.
3 Конечно, флуоресцентный зонд также должен быть устойчив к подавлению лазерного луча STED.
