Создание первого неонатального гематоэнцефалического барьера на чипе
Исследователи из Университета Темпл использовали "мозг на чипе" SynBBB для моделирования свойств и функций неонатального гематоэнцефалического барьера (BBB). Модель SynBBB точно имитирует микросреду in vivo, включая трехмерную морфологию, клеточные взаимодействия и характеристики потока на микрофлюидном чипе. Эта работа стала первой динамической неонатальной моделью BBB in vitro, которая обеспечивает визуализацию и анализ в реальном времени, подходящие для изучения функции BBB и скрининга новых терапевтических средств.
A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip Authors: S. Deosarkar, B. Prabhakarpandian, B. Wang, J.B. Sheffield, B. Krynska, M. Kiani. PLOS ONE, 2015, DOI: 10.1371/journal.pone.0142725
Модели SynBBB включают тканевый отсек и сосудистые каналы, расположенные рядом и разделенные инженерным пористым барьером. Поэтому исследователи смогли совместно культивировать эндотелиальные клетки мозга новорожденных крыс и астроциты крыс в физиологических условиях, наблюдаемых in vivo. Эндотелиальные клетки формировали полный просвет и демонстрировали образование плотного соединения, которое увеличивалось при совместном культивировании с астроцитами. Проницаемость малых молекул в гематоэнцефалическом барьере на чипе оказалась в отличном согласии с наблюдениями in vivo. SynBBB демонстрирует значительно улучшенную барьерную функцию по сравнению с моделью Transwell и близко приближается к проницаемости in vivo BBB.

|
|
SynBBB и Transwell BBB были построены с использованием неонатальных RBEC в присутствии ACM. Проницаемость для декстрана 40 кДа в SynBBB значительно ниже, чем в трансвелле, но не отличается от проницаемости in vivo BBB у новорожденных крыс.
|
Взаимодействие астроцитов и эндотелиальных клеток мозга крысы на пористом интерфейсе между сосудистым руслом и тканевым компартментом
|
Разработка противоопухолевого барьера на чипе
Permeability Across a Novel Microfluidic Blood-Tumor-Barrier Model Authors: Tori B. Terrell-Hall, Amanda G. Ammer , Jessica I. G. Griffith and Paul R. Lockman Fluids and Barriers of the CNS (2017) 14:3
В этом исследовании команда доктора Локмана адаптировала модель SynVivo BBB для разработки и описания модели BTB. Результаты исследования показывают, что модель BTB in vitro имитирует BTB in vivo в отношении проницаемости и свойств эффлюкса. Кроме того, модуляция проницаемости с помощью ингибиторов была легко определена количественно и очень хорошо сопоставлена с наблюдениями in vivo. По словам д-ра Локмана, "хотя некоторые модели in vitro имеют компонент потока, этот анализ является первым в истории созданием барьера кровь-опухоль с использованием коммерчески доступной микрофлюидной модели с напряжением сдвига, аналогичным наблюдаемому in vivo, в дополнение к визуализации и количественной оценке в реальном времени". Эта модель кровяного опухолевого барьера закладывает основу для использования в скрининговых анализах для открытия лекарств и понимания заболеваний центральной нервной системы.

|

|
Репрезентативное ярко-полевое изображение накопления красителя родамина 123 в центральном отделе после 90 мин перфузии в модели BBB без ингибитора (а) и с ингибитором (б). Скорость накопления флуоресцентного красителя Rho123 в центральном отделе после 90 мин перфузии красителя в чипах BBB и BTB (c). Скорость накопления флуоресцентного красителя в чипах BBB (г) и BTB (д), перфузированных Rho123 ± ингибиторами P-gp (циклоспорин А или верапамил). Статистическая значимость определялась с помощью одностороннего ANOVA с последующими тестами множественного сравнения Тьюки и t-теста Стьюдента; *p < 0,05 значимость между моделями трассировки и неограниченной диффузии, n = 3-4; +p < 0,05 значимость между моделями BBB/BTB и добавлением ингибитора, n = 3-6. Все данные представляют собой среднее ± SEM. Масштабные линейки белого прямоугольника 500 мкм
SynBBB кровяной противоопухолевый барьер (Blood-Brain Barrier) на чипе улучшает понимание переноса терапии через гематоэнцефалический барьер
Trastuzumab Distribution in an In-Vivo and In-Vitro Model of Brain Metastases of Breast Cancer Authors: Tori B. Terrell-Hall, Mohamed Ismail Nounou, Fatema El-Amrawy, Jessica I.G. Griffith and Paul R. Lockman Oncotarget. 2017; 8:83734-83744
Исследователь Пол Локман и его коллеги из Университета Западной Вирджинии сообщают об одном из первых исследований по мониторингу и количественной оценке перемещения трастузумаба (Herceptin®) через гематоэнцефалический барьер с помощью SynVivo Blood-Brain Barrier - Кровяно-мозговой барьер (BBB) на чипе. Трастузумаб — это моноклональное антитело, которое широко используется для лечения HER2+ рака молочной железы. В исследовании, опубликованном в журнале Oncotarget под названием "Распределение трастузумаба в in-vivo и in-vitro модели метастазов рака молочной железы в мозг", модель BBB компании SynVivo была адаптирована для создания модели кровяного барьера опухоли (BTB). Модель состояла из клеток HER2+ рака молочной железы с последующим мониторингом в реальном времени распределения антитела трастузумаб в тканях. Данные показали, что проницаемость трастузумаба in-vivo увеличивается от BBB к BTB, аналогично тому, что наблюдалось в модели SynVivo.
По словам доктора Локмана, "разработка модели in vitro, способной предсказывать реакцию in vivo через BBB, имеет решающее значение для развития нашего понимания и терапевтических стратегий при заболеваниях головного мозга". Микрофлюидические 3D модели тканей, разработанные компанией SynVivo и подтвержденные in vivo, представляют собой ценный ресурс для расширения трансляционных исследований в области открытия и доставки лекарств.

Механизм перемещения трастузумаба. Линейное накопление t-Rho123 в центральном отсеке в моделях микрофлюидных чипов in-vitro BBB и BTB. Репрезентативное изображение модели с меченым TRITC t-Rho123, протекающим над клетками HUVEC во внешнем отсеке и либо астроцитами, либо раковыми клетками JIMT-1 в центральном отсеке (A). Скорость перемещения t-Rho123 в каждой модели построена против кина неограниченной диффузии; ** p<0,0033 значимость между моделью BBB и кином неограниченной диффузии, n=3; *** p<0,0005 значимость между моделью BTB и кином неограниченной диффузии, n=3. Все данные представляют собой среднее ± S.E.M. Каждая модель значительно отличается от 0 (p < 0,05) (B). Репрезентативные графики скорости накопления t-Rho123 в BBB (C) и BTB
SynBBB Blood-Brain Barrier на чипе используется для скрининга новых терапевтических средств в режиме реального времени
Protein Kinase C-Delta Inhibition Protects Blood-Brain Barrier from Sepsis-Induced Vascular Damage Authors: Yuan Tang, Fariborz Soroush, Shuang Sun, Elisabetta Liverani, Jordan C. Langston, Qingliang Yang, Laurie E. Kilpatrick, and Mohammad F. Kiani. J Neuroinflammation. 15: 309 (2018).

Активация PKCδ является ключевым сигнализирующим событием, которое изменяет структурную и функциональную целостность BBB, что приводит к повреждению сосудов и повреждению тканей, вызванному воспалением. Пептидный ингибитор PKCδ-TAT обладает терапевтическим потенциалом для предотвращения или уменьшения цереброваскулярного повреждения при сепсисе, вызванном повреждением сосудов.
В данной публикации сообщается об использовании модели гематоэнцефалического барьера для выяснения регуляции и относительного вклада протеинкиназы С-дельта в контроль отдельных этапов нейровоспаления при сепсисе. Также была изучена роль ингибитора пептида PKC-delta-TAT в качестве потенциального терапевтического средства для предотвращения или уменьшения цереброваскулярного повреждения при сепсисе-индуцированном повреждении сосудов. Целостность сосудов оценивалась с помощью модели совместной культуры SynBBB с первичными эндотелиальными клетками микрососудов головного мозга человека и астроцитами. Проницаемость эндотелиальных клеток, TEER и трансмиграция нейтрофилов оценивались напрямую. SynBBB также позволяла в режиме реального времени отслеживать взаимодействие нейтрофилов и эндотелия в физиологически соответствующих условиях потока.
Человеческий Blood-Brain Barrier на чипе, разработанный с использованием линии эндотелиальных клеток головного мозга hCMEC/D3 и первичных астроцитов человека
A Microfluidic Model of Human Brain (uHuB) for Assessment of Blood-Brain Barrier Authors: Tyler D. Brown, Maksymillian Nowak, Alexandra V. Bayles, Balabhaskar Prabhakarpandian, Pankaj Karande, Joerg Lahann, Matthew Helgeson, Samir Mitragotri. Bioengineering and Translational Medicine. 15: 309 (2019; 4:e10126)

|

|
Клеточная линия hCMEC/D3 образует полный просвет под протоком и демонстрирует соответствующие маркеры узких соединений.
|
Совместная культура hCMEC/D3 и первичных астроцитов в человеческом SynBBB Blood-Brain Barrier на чипе
|
(a-f) Конфокальные изображения монослоев hCMEC/D3 в μHuB после кондиционирования в потоке, окрашенные ActinRed™ 555 ReadyProbes™ (актин, красный) и Hoechst 33342 (ядро, синий). (a) Вид в перспективе на устройство μHuB, состоящее из двух сосудистых (апикальных) отсеков, выстланных монослоями hCMEC/D3. (b) Вид в поперечном сечении монослоев hCMEC/D3 в μHuB, образующих полный внутренний просвет приблизительно 200 мкм (ширина) на 100 мкм (высота). (c) Вид в перспективе на один квадрант модели μHuB, выделенный желтым цветом в (a). (d) Нижняя половина (c), выложенная полным монослоем hCMEC/D3. (e) Поперечное сечение внутреннего просвета. (f) То же поперечное сечение, что и (e), при угле обзора 90°.
|
Монослои hCMEC/D3 (зеленый) культивировались в сосудистом (апикальном) компартменте с первичными астроцитами человека (красный) в тканевом (базолатеральном) компартменте (ядра, синий). (a) Вид сверху на полную трехмерную реконструкцию модели ко-культуры SynBBB. (b) Увеличенная желтая область (a) со стрелками, указывающими на области, где концевые пальцы астроцитов выступают в монослой hCMEC/D3. (масштабная линейка для b = 20 мкм
|
Совместное культивирование с эндотелиальными клетками и астроцитами
Первичные эндотелиальные клетки мозга крысы и астроциты совместно культивируются в устройстве SynBBB. Увеличение омического сопротивления через барьер, измеренное с помощью анализатора импеданса клеток, связано с образованием плотных соединений через BBB. Эндотелиальные клетки, совместно культивированные с астроцитами, образуют значительно более плотные клеточные соединения по сравнению с монокультивированными эндотелиальными клетками.

CD-31 (зеленый) окрашивает эндотелиальные клетки, а GFAP (красный) окрашивает астроциты. Все ядра окрашены DAPI (синий).
|

Схема, показывающая увеличение TEER при совместном культивировании эндотелиальных клеток и астроцитов.
|
Модель монокультуры с эндотелиальными клетками головного мозга
Индуцированные сдвигом плотные соединения эндотелиальных клеток, которых невозможно достичь в модели Transwell®, легко достигаются в анализе SynBBB с помощью перфузии жидкости. Образование плотных изменений может быть измерено с помощью биохимического или электрического анализа (оценка изменений электрического сопротивления) с помощью анализатора импеданса клеток SynVivo.

Первичные эндотелиальные клетки культивируются в сосудистом русле в условиях физиологического потока жидкости. Клетки окрашиваются на маркеры плотных спаек, что подчеркивает их увеличение при потоке жидкости по сравнению со статическими условиями. Система анализатора импеданса клеток используется для измерения увеличения омического сопротивления (TEER), связанного с образованием плотных спаек.
Анализы проницаемости в реальном времени
В отличие от моделей BBB, которые расположены по принципу "сверху вниз" (например, Transwell), транспорт малых молекул может быть оценен и количественно определен в режиме реального времени в системе SynBBB благодаря ее архитектуре "бок о бок". Флуоресцентно меченную молекулу интересующего препарата пропускают через сосудистые каналы при физиологической скорости потока. Видео в реальном времени приобретается и анализируется для расчета скорости проницаемости в тканевую камеру. Различные скорости проницаемости наблюдаются в разных участках BBB из-за плотного соединения эндотелиальных клеток.
Модуляция плотного соединения в реальном времени
SynBBB можно использовать для моделирования реакции на воспаление. Провоспалительное соединение, такое как TNF-α, добавляется к монокультивированным эндотелиальным клеткам для модуляции плотных сочленений, после чего следует период восстановления в условиях перфузионного потока. Измерение электрического сопротивления обеспечивает неинвазивный метод мониторинга плотных сочленений в режиме реального времени.

Модуляция воспалительных реакций в модели SynBBB. TNF-альфа индуцировал утечку в BBB, измеряемую по изменению сопротивления через эндотелиальные клетки. Удаление TNF-альфа с последующей перфузией среды в условиях физиологического потока позволяет восстановить плотные спайки, что приводит к увеличению образования плотных спаек. Статические клетки сохраняют постоянное сопротивление из-за отсутствия плотных соединений.