Арт. STEDYCON
Функция рассеяния точки (PSF) снижает разрешение микроскопа, поскольку ее размытие делает две точки неразличимыми на результирующем изображении. Физическая ширина PSF не может быть меньше дифракционного предела, но технологии сверхразрешения обходят этот предел, создавая PSF с эффективной шириной до 20 нм или меньше. Одна из стратегий обхода дифракционного предела в значительной степени зависит от потока фотонов от флуорофора. Больше фотонов на излучатель — это хорошо. Другая обходная стратегия сужает ширину PSF, ограничивая область, в которой может излучать флуорофор. Более узкая полуширина (FWHM) PSF — это хорошо.
Взаимодействие между этими двумя параметрами — FWHM и числом фотонов от излучателя — заслуживает более пристального внимания.
Возьмите два излучателя, разделенные расстоянием 150 нм, и получите их изображения несколько раз. Теперь давайте посмотрим, что происходит с профилями интенсивности их PSF, когда мы изменяем полуширину и количество фотонов, испускаемых флуорофорами. На приведенном ниже рисунке каждая цветная линия представляет собой отдельный прогон визуализации.
Профили линий, два излучателя на расстоянии 150 нм
|
|
Полная ширина на полувысоте (FWHM) [нм] |
|
|
Количество фотонов на излучатель (PPE) |
Низкая скорость испускания фотонов приводит к зашумленному PSF, резко ограничивающему возможность различения двух излучателей. Однако этот шум становится менее значимым при разделении двух PSF, когда у вас более узкая полуширина. Посмотрите на рисунок слева направо. Что удивительно, так это то, что для небольшой FWHM достаточно всего нескольких фотонов, чтобы четко различить две PSF. Возможно: узкая полуширина разделяет сигналы двух флуорофоров, несмотря на низкое и непостоянное обнаружение фотонов между прогонами.
Разрешение также улучшается по мере увеличения количества фотонов, излучаемых каждым испускающим флуорофором. Посмотрите на рисунок сверху вниз. Отдельные измерения становятся более согласованными, что позволяет выявить отчетливый провал между двумя профилями интенсивности PSF. Хорошо видно, что, если полуширина слишком велика, даже большее число фотонов, чем в нашем примере, уже не улучшит разрешение.
Ключевым моментом, однако, является то, что разрешающая способность микроскопа быстрее улучшается при более узкой полуширине, даже при более низком потоке фотонов от флуорофоров. Мы разобрали два рычага, которые есть в вашем распоряжении для достижения более высокого разрешения. Который из них даст вам больший доступ к наномиру? Как это часто бывает в жизни, это зависит от обстоятельств! Однако ясно одно: чем уже FWHM, тем меньше фотонов требуется для визуализации с высоким разрешением.
