Арт. STEDYCON
Вы удивлены тем, что сама природа света ограничивает разрешение, которого мы можем достичь в микроскопических изображениях? К счастью, есть обходные пути для этого ограничения. Эти обходные пути увеличивают количество деталей на изображении, точно манипулируя тем, где и когда разрешено излучать флуорофоры. Таким образом, они предоставляют нам совершенно новый набор инструментов для сокращения расстояния между двумя точками, при этом сохраняя возможность их разрешения. Но что, в первую очередь, означает «разрешение»?
Что означает термин разрешение
Разрешение — это одна из тех концепций, которые всем кажутся понятными, но затем они оказываются раздражающе запутанными. Сам термин используется довольно без разбора для обозначения разных вещей. Есть разрешение изображения, угловое разрешение, спектральное разрешение и так далее. Как правило, все эти термины отражают способность раскрывать детали объекта, но есть нюансы. Итак, давайте начнем с того, что четко сформулируем, о чем эта статья. Для световой микроскопии разрешение — это наименьшее расстояние между двумя точками образца, которое позволяет различить микроскоп. В частности, в контексте флуоресцентной микроскопии разрешение определяет пространственный интервал между двумя флуорофорами. Чем ближе могут быть два флуорофора, оставаясь при этом различимыми на результирующем изображении, тем меньше это расстояние и, следовательно, тем больше разрешается деталей.
Так насколько маленьким может быть это расстояние?
Неустранимое размытие
Во-первых, нам нужно знать, что ограничивает разрешение. Несколько компонентов микроскопа влияют на его разрешающую способность. Некоторые из них влияют на вашу способность использовать разрешение. Например, детектор (камера, датчик) с малым количеством пикселей не будет фиксировать детали, достигаемые за счет высокой разрешающей способности. Обратное утверждение тоже верно. Камера с самым большим количеством пикселей в мире не добавит деталей к изображению, полученному с помощью микроскопа с низким разрешением. Точно так же увеличение делает больше изображение образца, но создание деталей напрямую1 зависит от разрешающей способности микроскопа.
На самом деле ограничивающими факторами разрешения являются свет, используемый для исследования образца, и способность оптических компонентов микроскопа собирать и фокусировать этот свет. У этой зависимости есть простая непреодолимая причина: свет, проходящий через объектив, дифрагирует. В результате изображение излучающего флуорофора размывается, выходит за пределы его реального размера. Когда размытые изображения двух флуорофоров перекрываются, они становятся неразличимыми. Чем больше размытие, тем дальше должны быть два флуорофора, чтобы их можно было различить. Бинго. Это размытие, называемое функцией рассеяния точки (PSF), ограничивает разрешение светового микроскопа.
1Предостережение: это один из тех запутанных случаев, о которых было упомянуто выше. Объективы большого увеличения часто также имеют высокую числовую апертуру. Как мы увидим, разрешение неразрывно зависит от числовой апертуры. Как следствие, есть большая вероятность, что при использовании объектива с большим увеличением вы также увеличите разрешение.
Пределы Рэлея, Спарроу и Аббе
PSF и ее тревожные последствия для разрешения в оптических системах беспокоили ученых на протяжении веков. Математик и астроном Джордж Бидделл Эйри впервые объяснил размытое изображение световой точки в 1835 году. Фактически, PSF идеально сфокусированной световой точки, сделанной с помощью идеальной линзы, названа в его честь: узор Эйри, который представляет собой центральный яркий диск Эйри, окруженный тусклыми концентрическими кольцами (рис.1)
Рис. 1 Диск Эйри
На рубеже 20-го века физики изучали, насколько близкими могут быть PSF двух точек, прежде чем они станут неразличимы. Выделяются три определения или «предела». Чтобы понять и сравнить их, стоит построить графики относительной интенсивности света в середине PSF, спроецированной на плоскость изображения (рис. 2). Центральный диск содержит основную часть интенсивности света (примерно 84 %), в то время как остальная часть распределена в виде пиков и впадин затухающей амплитуды, соответствующих концентрическим кольцам, расходящимся от центра.
Рисунок 2. Профиль интенсивности: распределение относительной интенсивности света функции рассеяния точки
Первый предел – это критерий Рэлея. Джон Уильям Статт, барон Рэлей III, заявил, что две световые точки равной силы разрешаются, когда они разделены как минимум на ширину диска Эйри (рис. 3А). Этот пространственный интервал допускает падение интенсивности света между двумя PSF на 20–30%, что заметно невооруженным глазом. Вторая версия предела разрешения появилась позже у физика Кэрролла Мейсона Спарроу, который определил его как расстояние, на котором интенсивность света остается постоянной между двумя PSF (рис. 3B). И, возможно, самый известный предел описан Эрнстом Аббе, который продемонстрировал, что разрешение любого светового микроскопа никогда не превышает половины длины волны света (рис. 3С).
|
Минимальное разрешимое расстояние между двумя точками — это диаметр центрального диска в PSF. |
Минимальное разрешаемое расстояние — это когда интенсивность света выходит на плато между двумя точками. |
Дифракция ограничивает разрешение светового микроскопа примерно до половины длины волны видимого света. |
|
|
|
|
|
Рис.3А Предел разрешения Рэлея |
Рис.3B Предел разрешения Спарроу |
Рис.3С Предел разрешения Аббе |
Апертуры и длины волн
Общими для всех трех определений предела разрешения являются два параметра, которые Аббе определяет в своей основополагающей статье2 как виновников разрешения, ограниченного дифракцией. Аббе был первым, кто ввел понятие числовой апертуры (NA) — меры, которая сочетает в себе угол конуса света, который может входить и выходить из объектива, и показатель преломления среды, в которой он работает, чтобы характеризовать его способность принимать и фокусировать свет. Аббе объяснил, что размер PSF определяется числовой апертурой объектива микроскопа и длиной волны света, используемого для изображения образца. Большие числовые апертуры и высокочастотный свет создают меньшую PSF, что, в свою очередь, сокращает разрешаемое расстояние между двумя точками или флуорофорами. Практическая аппроксимация предела разрешения Аббе позволяет эмпирически измерить разрешение флуоресцентного микроскопа. Если вы изображаете флуоресцентную бусину, вы можете измерить полную ширину ее центрального пика PSF при половинной максимальной интенсивности (FWHM, рис. 4). Измерение разрешения микроскопа — тема отдельной статьи.
Abbe, E. 1873. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für Mikroskopische Anatomie 9:413–468.
Рис. 4 Разрешение на полувысоте. Полная ширина PSF на половине ее максимума является общей оценкой разрешения.
Итак, это все? Расстояние не может стать меньше?
Разрешающая способность Аббе или дифракционный предел в принципе неопровержимы. Конечно, вы можете использовать объективы с большей числовой апертурой и более высокой частотой света. Но, к сожалению, числовая апертура современных флуоресцентных микроскопов находится на практическом максимуме (около 1.4 для объективов с масляной иммерсией), и использование ультрафиолетового или рентгеновского света повреждает образцы. Это означает, что мы ничего не можем сделать с нашей микроскопической системой, чтобы еще больше уменьшить d (расстояние между разрешающимися точками). Но есть еще один игрок в создании изображения: флуорофор. Манипулирование включенными/выключенными состояниями флуорофоров — это еще один рычаг, который мы можем использовать для уменьшения d, и, таким образом, обходной путь, который изменяет нашу аппроксимацию предела разрешения, добавляя третий параметр.
Одним из примеров является микроскопия методом подавления спонтанного испускания (STED). В STED лазерный луч возбуждения, используемый для запуска излучения флуорофора, накладывается на второй луч девозбуждения в форме пончика, который подавляет это возбуждение. В результате флуоресцируют только флуорофоры в центре кольцевидного луча. Увеличение интенсивности света девозбуждающего луча сужает область, в которой флуорофоры могут флуоресцировать, до существенно меньшего диаметра, чем дифракционный предел Аббе (примерно 200 нм). Таким образом, флуорофоры могут быть намного ближе друг к другу и все же различаться под микроскопом.
Интенсивность девозбуждающего света является здесь частью параметра «обходного пути» и может использоваться для аппроксимации диаметра суженной области флуоресценции на основе реакции флуорофоров на девозбуждающий свет. Интегрируя это приближение в нашу меру разрешения:
где Isat — константа, зависящая от флуорофора, представляющая интенсивность света, при которой излучение флуорофора уменьшается наполовину, а I — регулируемая интенсивность луча девозбуждения.3 Увеличение I увеличивает знаменатель и, следовательно, уменьшает d. Теоретически d может стать бесконечно малым.
Harke, B. et al. 2008. Resolution scaling in STED microscopy. Opt. Express 16: 4228–4244.
Обратите внимание, что PSF как возбуждающих, так и девозбуждающих световых лучей по-прежнему ограничены дифракцией. Мы не можем сделать их меньше. Однако их взаимодействие с состояниями флуорофора разрушает дифракционный барьер.
Другим примером этого обходного пути является микроскопия локализации одиночных молекул (SMLM). SMLM включает в себя механизм, который гарантирует, что в любой момент времени только несколько редко расположенных, неперекрывающихся флуорофоров образца находятся в состоянии, когда они могут флуоресцировать. Делается «моментальный снимок» этих флуорофоров. Затем новое подмножество флуорофоров переходит в флуоресцентное состояние и создается еще один «моментальный снимок». Полное изображение строится из нескольких «моментальных снимков», каждый из которых представляет собой отдельное случайное созвездие флуорофоров.
Локализация каждого флуорофора в каждом снимке — это способ преодоления предела разрешения. Количество фотонов, испускаемых и регистрируемых одним флуорофором, следует распределению, сосредоточенному вокруг вероятного местоположения флуорофора. Таким образом, если детектировано достаточное количество фотонов, вероятное местоположение флуорофора может быть сужено до области, значительно меньшей, чем PSF. И вот оно: новый параметр «обходного пути» — количество излучаемых фотонов. Включение этой вероятности в нашу меру разрешения выглядит следующим образом:
где Ne — среднее число испускаемых фотонов на один флуорофор. Чем больше регистрируемых фотонов излучения, тем больше знаменатель и, следовательно, тем меньше становится d. Как и в случае STED, d теоретически может стать бесконечно малым.
Слишком много хорошего
STED и SMLM либо направляют много света на образец, либо захватывают много света от образца, управляют включением/выключением флуорофоров и, таким образом, исключают размытие PSF. И, хотя оба варианта бесконечно улучшают разрешение, именно их «обходные пути» ограничивают их разрешающую способность. MINFLUX, технология сверхвысокого разрешения нового поколения, обеспечивающая разрешение в нанометровом масштабе, полностью избегает этого, полностью обновляя концентрацию флуорофора. Но это тоже тема для других статей.
