Арт. MultiSplit
Методы микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM) (PALM, PAINT, и STORM) стали важными инструментами для доступа к биологической информации в наномасштабе. Эти методы позволяют получить разрешение достаточное для визуализации структур с квази-изотропной точностью трехмерной локализации ~ 10 нм. Однако SMLM зависит от характеристик фотопереключения флуорофора, которые в свою очередь зависят от длины волны и значительной хроматической аберрации в наномасштабе. Эти проблемы затрудняют получение простых многоцветных изображений с помощью SMLM. До сих пор доступ к многоцветной информации осуществлялся путем последовательного сбора данных на разных длинах волн возбуждения, что могло вызывать неконтролируемые дрейфы между измерениями для разных цветов.
Но теперь исследователи продемонстрировали новое решение, в котором для возбуждения нескольких флуорофоров в одном и том же спектральном диапазоне (дальний красный) используется только один лазер в сочетании со стратегией спектрального разделения, которая преодолевает эти ограничения и позволяет выполнять многоцветную 3D-наноскопию с повышенными показателями скорости и надежности выходных данных, а также значительно упрощает процесс.
Принцип SAFe RedSTORM
Сообществом SMLM были предложены различные методы, основанные на алгоритме спектрального разделения. Благодаря развитию этих методов недавно было продемонстрировано, что простой и надежный ратиометрический метод может использоваться для спектрального разделения вкладов флуоресцентного излучения красных красителей; это позволяет получать многоцветные изображения. С помощью этого нового метода флуоресцентное излучение разделяется длинноволновым дихроичным фильтром (например, при 700 нм) на два отдельных пути, прежде чем достигнет двух камер (см. рис. 1a и 1d). Счет фотонов осуществляется на обеих камерах, и вычисленное отношение - R - связано со спектральным разделением. Таким образом, R представляет собой идентификатор ƛ (см. Рис. 1c). На этом этапе процесса основную роль играют два параметра: диапазон, выбранный для ƛ, и процент отклоненных молекул. Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму перекрестные помехи для лучшего разделения различных структур, в то же время отклоняя как можно меньше регистрируемых излучений для качественной реконструкции.
Рис. 1. Нормированные спектры двух типичных красных красителей, AF647 и CF680, с характеристикой длинноволнового дихроичного фильтра на 700 нм для разделения двух излучений (а); пример записи PSF (прогрессивных сегментированных кадров) на камеры 1 и 2 (b, вверху), увеличение (b, середина) и 2D гауссовского представления PSF для оценки положения центра и подсчета фотонов (b, внизу); распределение отношения фотонов и пример диапазонов, выбранных для назначения ƛ (c); оптический путь для спектрального разделения: первый дихроичный фильтр отделяет возбуждение от испускаемого образцом излучения - свет излучения затем разделяется с помощью второго дихроичного длинноволнового фильтра на две камеры (d); и пример реконструкции изображения клетки Cos7, меченной AF647 и CF680 (e).
Пример полученного многоцветного наноразмерного изображения показан на рисунке 1e - это реконструкция клетки Cos7, меченной AF647 и CF680 и возбуждаемой одним мощным лазером с длиной волны 640 нм. Эта новая стратегия спектрального разделения реализована в специальной системе Abbelight, SAFe RedSTORM, а также в Abbelight SAFe360 с максимальным диапазоном. Оба модуля могут быть адаптированы к любому инвертированному микроскопу, от простых широкопольных микроскопов до более сложных конфокальных конфигураций или конфигураций с вращающимся диском, чтобы превратить микроскопию в наноскопию.
Рис. 2. Схематическое изображение многоцветной установки SMLM с использованием одного красного лазера на длине волны 640 нм, подключенного к системе визуализации через одномодовое волокно.
Схематическое изображение установки многоцветной визуализации SMLM показано на рисунке 2. Возбуждающий свет (здесь, пример системы с одним лазером Cobolt Rogue на 640 нм мощностью 1 Вт) передается через оптическое волокно в модуль SAFe RedSTORM. Он адаптирован для визуализации флуоресценции с полным внутренним отражением (TIRF) с большим полем обзора (FOV) или для получения изображений с помощью метода HiLo (микроскопия сильно наклоненного и многослойного оптического листа) с использованием светового модуля Abbelight SAFe. Затем излучение передается в корпус микроскопа через дихроичный фильтр. Испускаемый образцом флуоресцентный свет собирается объективом и направляется обратно в модуль SAFe RedSTORM для спектрального разделения и одновременной регистрации двумя камерами. Используя схему освещения с технологией адаптируемого сканирования для настраиваемых областей возбуждения (ASTER), эта установка для визуализации способна генерировать равномерное возбуждение в режимах EPI, HiLo или TIRF в адаптируемых полях зрения размером до 200 × 200 мкм, что в 25 раз больше, чем в обычном микроскопе (см. рис. 3).
Рис. 3. Реконструкция изображения (одновременная съемка 2 цветов) клеток Cos7, помеченных Af647 и CF680.
Основное преимущество этого подхода к спектральному разделению состоит в том, что для двухцветного возбуждения требуется только один лазер, поскольку все используемые флуоресцентные красители возбуждаются в одной и той же спектральной области. Кроме того, уменьшаются хроматические аберрации и отпадает необходимость в коррекции дрейфа между разными цветами возбуждения - информация о длине волны записывается за один прием. Простота и надежность процесса таковы, что прямая многоцветная визуализация в наномасштабе достигается как в 2D, так и в 3D, обеспечивая максимальные перекрестные помехи на уровне 10% в наихудшем сценарии для трех красителей в 3D (с типичными значениями ниже 1% для двух красителей в 2D).
SAFe RedSTORM визуализация для нейробиологии
Микроскопия сверхвысокого разрешения стала мощным инструментом для понимания фундаментальных нейронных функций, таких как передача информации между нейронами в синапсах. Ключевые задействованные белки четко организованы, и эта наноразмерная организация точно настраивает эффективность синаптической передачи. Однако измерение данных процессов может быть затруднено из-за хроматической аберрации. Таким образом, спектральное разделение многоцветных SMLM может быть мощным инструментом для изучения такой организации.
Чтобы исследовать эти возможности многоцветного SMLM в неврологии, доктор Бенджамин Компанс и его коллеги из лаборатории Беррона в Королевском колледже Лондона изучили два белка, участвующих в синаптической передаче. Bassoon и ГАМКа рецепторы (GABAaR) были помечены AF647 и CF680, соответственно, и визуализированы в системе Abbelight SAFe RedSTORM. Комбинированное изображение этих белков с большим полем обзора и многоцветным сверхвысоким разрешением показано на рисунке 4.
Рис. 4. Реконструкция изображения двухцветного спектрального разделения 3D-dSTORM на нейронах гиппокампа, помеченных AF647 (оранжевым для Bassoon) и CF680 (синим, GABAaR). Большой угол обзора 100 × 100 мкм (левое изображение) и увеличение синапсов (три изображения справа). Образец подготовлен и отображен на SAFe RedSTORM доктором Бенджамином Компансом, лаборатория Burrone в Королевском колледже Лондона. Спектральная ширина линии лазера Cobolt Rogue составляет 0.2 нм, что соответствует длине когерентности около 2 мм; пучок TEM00 с М2 менее 1.1.
Лазеры для SMLM
В SMLM высокая освещенность (несколько киловатт на квадратный сантиметр) имеет решающее значение для достижения одномолекулярного режима и обеспечения количественной визуализации в наномасштабе. Это становится еще более важным при одновременном отображении трех разных флуорофоров с плотностью, необходимой для SMLM с большим полем обзора. Необходимость высокой освещенности для возбуждения множества флуорофоров с наноразмерным разрешением при большом поле зрения и на высоких скоростях приводит к необходимости в мощных лазерных источниках. В связи с этим наличие новых компактных мощных лазерных источников в красном спектральном диапазоне способствует разработке упрощенной технологии получения многоцветных изображений SMLM с высокой пропускной способностью.
Непрерывный (CW) лазер Cobolt Rogue с длиной волны 640 нм и мощностью 1 Вт подходит для одновременного возбуждения нескольких красных красителей, таких как AF647 и CF680. Этот лазер с диодной накачкой излучает дифракционно ограниченный пучок ТЕМ00 с одной поперечной модой, который обеспечивает эффективное соединение с одномодовыми волокнами с сохранением поляризации для эффективной доставки излучения в микроскоп.
Лазер работает в режиме генерации нескольких продольных мод в сочетании с шумом малой интенсивности; это довольно необычно для лазерной техники с диодной накачкой в видимом спектральном диапазоне. Как правило, непрерывные лазеры видимого диапазона с диодной накачкой основаны на внутрирезонаторном преобразовании частоты. Важно, чтобы лазер работал в режиме одной продольной резонаторной моды, чтобы избежать шума интенсивности, возникающего из-за хаотических флуктуаций между конкурирующими модами в резонаторе с несколькими продольными модами - так называемого «зеленого шума».
Работа в режиме одной продольной моды (SLM или одночастотный режим) обычно достигается с помощью механизмов спектральной фильтрации внутри резонатора, что в некоторой степени снижает выходную мощность. Поскольку Cobolt Rogue работает непосредственно на основной длине волны и без преобразования частоты, можно работать с лазером в режиме с несколькими продольными модами и по-прежнему с низкоинтенсивным шумом. Это означает, что спектральная фильтрация не требуется, и, таким образом, позволяет масштабировать выходную мощность.
Лазер Cobolt Rogue основан на лазерных кристаллах, легированных Pr3+, которые представляют собой относительно новый класс лазерных источников с диодной накачкой на рынке. Реализация и развитие производства с использованием этой лазерной технологии стали возможными благодаря разработкам в области диодной накачки в видимом диапазоне. Преимущество этих лазеров состоит в том, что они излучают непосредственно в видимом диапазоне, а это означает, что выходную мощность можно легче масштабировать в небольших форматах, работая с лазером в режиме с несколькими продольными модами, при этом излучая идеальный пучок с одной поперечной модой. Другим преимуществом работы в режиме с несколькими продольными модами в приложениях визуализации является то, что более широкий оптический спектр уменьшает длину когерентности, что, в свою очередь, снижает влияние спекл-эффектов на качество изображения или интерференции от поверхностей на пути луча. Это особенно важно в приложениях для получения изображений, где освещаются большие площади.
Используя лазерную технологию, которая излучает непосредственно в видимом диапазоне, в конфигурации с несколькими продольными модами и в сочетании с технологией сборки, основанной на высокоточной установке миниатюрной оптики в терморегулируемые, герметичные платформы, можно достигнуть выходной мощности на уровне 1 Вт в идеальном пучке TEM00 с очень высоким уровнем стабильности выходного сигнала даже в меняющихся условиях окружающей среды благодаря компактному корпусу лазера размером 115 × 55 мм.
Заключение
Комбинация излучения компактного мощного красного лазера, передаваемого через одномодовое волокно с сохранением поляризации, с технологией Abbelight SAFe RedSTORM, которая ориентирована на ратиометрический подход к спектральному разделению вкладов флуоресцентного излучения красителей, излучающих красный цвет, позволила реализовать многоцветную 3D-наноскопию, которая способна регистрировать изображения в наномасштабе с большим полем обзора (до 200 × 200 мкм2) и с нанометровой точностью локализации (15 нм). Разработанную технологию легко интегрировать и использовать, а значит, она широко доступна.
