Что такое микроскопия PALM?
Микроскопия PALM - это метод микроскопии сверхвысокого разрешения, а название PALM - сокращение от «Фотоактивированная локализационная микроскопия». Техника была изобретена Эриком Бетцигом вместе со своим коллегой Харальдом Хессом, и эта работа получила международное признание благодаря присуждению Нобелевской премии по химии 2014 года. Бетциг поделился наградой со Стефаном Хеллом и Уильямом Мёрнером за их вклад в прорыв дифракционного барьера при флуоресцентной микроскопии с помощью метода STED микроскопии.
Микроскопия PALM использует фотоактивируемые флуорофоры для различения пространственных деталей плотно упакованных молекул. После активации лазерами флуорофоры излучают в течение короткого периода времени, но в конечном итоге обесцвечиваются. Лазер стохастически активирует флуорофоры, пока все не испустятся. Важно отметить, что, активируя их случайным образом и в меньших количествах, можно получить более точное представление об их положениях, что делает микроскопию PALM ключевой техникой локализационной микроскопии.
Сигналы от каждого флуорофора по-прежнему подвержены дифракции света около 300 нм. Однако, поскольку каждый из них был активирован отдельно, центр масс может быть точно рассчитан. Функция разброса точек (PSF) используется для определения местоположения с разрешением до 20 нм. Путем сопоставления каждой из более точно определенных точек можно получить полное микроскопическое изображение с высоким разрешением.
Микроскопия PALM может сочетаться с микроскопией TIRF или микроскопией HILO для улучшения отношения сигнал / шум более тонкого образца. Это открывает возможности для исследователей, изучающих мембраносвязанные белковые комплексы или более мелкие везикулы.
Изображение: Отслеживание одной частицы T3SS-HALO, окрашенного JF549 в живых бактериях. Образец предоставлен доктором А. Дипольдом, Институт наземной микробиологии им. Макса Планка, Марбург, Германия. Масштабная шкала составляет 1 мкм.
Какие флуорофоры можно использовать для микроскопии PALM?
Микроскопия PALM и микроскопия STORM используют стохастическую активацию отдельных флуорофоров для различения пространственных деталей путем определения точных положений отдельных молекул. Три обычно используемых типа флуорофоров:
- Фотоактивируемые флуорофоры: в настоящее время наиболее распространенными являются фотоактивируемые белки, например, PAmCherry, PA-GFP, которые излучают свет при активации ультрафиолетовым светом;
- Фотоконвертируемые флуорофоры: флуоресцентные белки, которые изменяют свой спектр излучения при активации ультрафиолетовым светом (например, белки mEOS);
- Фотопереключаемые флуорофоры: обычно химические красители (например, Alexa Fluor 647, DyLight555), которые могут неоднократно переключаться между темными, не флуоресцентными и яркими флуоресцентными состояниями.
Флуорофоры постоянно развиваются. Новые красители часто фотоактивируются на более длинных волнах излучения, которые более благоприятны для живых образцов. В настоящее время доступны некоторые флуорофоры, которые можно фотопереключать и фотоактивировать, предоставляя дополнительные возможности для получения изображений.
Как можно использовать микроскоп PALM?
Микроскопы PALM могут быть использованы для локализационной микроскопии фиксированного образца, чтобы описать сложные детали анализируемых образцов с разрешением, достигающим 20 нм. Использование фотоактивируемых или фотоконвертируемых белков позволяет вести подсчет молекул, например, в комплексах и кластерах.
Другое приложение - отслеживание одиночных частиц в живых клетках. Стохастически активируя отдельные флуорофоры, мы можем отслеживать движение молекул во времени, вычислять коэффициенты диффузии и описывать поведение частиц.
Изображение: Отслеживание одной частицы HALO-меченного белка FtsK, связанного с лигандом TMR в клетках Mycobacterium smegmatis, образцы предоставлены лабораторией Zakrzewska-Czerwinska, Вроцлавский университет, Польша. Масштабная шкала составляет 0,5 мкм, цветовая шкала 0-6 мкм2/с.
Почему следует рассматривать микроскоп Nanoimager для микроскопии PALM?
В качестве микроскопа PALM, необычайная чувствительность, стабильность и точность микроскопа Nanoimager делают его отличным инструментом для точных измерений с использованием методов микроскопии STORM и PALM. Он способен получать изображения в четырех цветах с двумя цветами, работающими одновременно, что позволяет отслеживать два разных вида флуорофора одновременно. Это позволяет осуществлять локализацию одной молекулы и относить следы, зарегистрированные в одном канале, к клеточным маркерам во втором канале.
Лазеры с цифровым управлением обеспечивают точные воспроизводимые результаты, а с помощью камеры sCMOS можно получать изображения с разрешением до 20 нм. Это надежный микроскоп с уникальным дизайном, поэтому его можно использовать в любом помещении лаборатории, а не только на оптических столах в темных комнатах. Конструкция естественным образом гасит вибрации, поэтому становится возможным получение чистого изображения с высоким разрешением. Микроскоп Nanoimager универсален, поэтому его не следует рассматривать только как микроскоп PALM. Он также может делать dSTORM микроскопию, отслеживание одиночной частицы и smFRET.
Микроскоп Nanoimager был использован в качестве микроскопа PALM для изучения отслеживания РНК-полимеразы в E.coli, отслеживания FtsK в Mycobacterium smegmatis и мембранных комплексов в бактериях.