Микроскоп Nanoimager

Что такое STORM-микроскопия?

С момента своего изобретения в 2006 году микроскопия STORM стала наиболее широко используемой техникой микроскопии сверхвысокого разрешения для визуализации одной молекулы. STORM расшифровывается как «Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия» и основывается на стохастической активации отдельных флуорофоров с фотоактивируемыми свойствами.

Во время визуализации по методу STORM микроскопии отдельные флуорофоры «мигают» в результате процесса случайной активации из выключенного или темного состояния во включенное или эмиссионное состояние, за которым быстро следует возврат в темное состояние или фотообесцвечивание. Этот процесс последовательно повторяется много раз, пока не будет определено местоположение большинства флуорофоров. Для успешной визуализации STORM микроскопии отдельные флуорофоры должны быть достаточно редкими, чтобы в любой момент времени в пределах области, ограниченной дифракцией, активировалась только одна молекула.

Во время процесса реконструкции STORM микроскопии отдельные молекулы могут быть точно локализованы путем определения их координат положения из фотонов, обнаруженных для каждого события активации (часто в виде функции Гаусса).

Изображение: dSTORM изображение миофибрилл поясничной мышцы кролика, меченных антителом к титину T12-AF647 (синий). Антитело локализуется в паре линий, по одной на каждой стороне Z-диска, разделенных расстоянием 160-200 нм. Образец предоставлен профессором Матиасом Гаутелем, доктором Полин Беннетт и доктором Сьюзен Кокс из Центра клеточной и молекулярной биофизики им. Рэндалла, Королевский колледж Лондона, Великобритания. Масштабная шкала составляет 0.5 мкм.

Какие флуорофоры можно использовать для микроскопии STORM?

Есть два типа STORM микроскопии. Первый, известный как прямая микроскопия STORM или dSTORM, совместима со многими обычно используемыми флуорофорами, которые могут быть переведены в отключенное состояние с использованием определенных параметров возбуждения и в сочетании со специальными буферами для получения кислорода. Идеальные флуорофоры для STORM микроскопии должны быть очень яркими, иметь высокую скорость фотопереключения и демонстрировать минимальное фотообесцвечивание в тиолсодержащих буферах.

Во втором типе микроскопии STORM используется пара красителей-активаторов-репортеров - «активатор» вызывает переключение, а «репортер» испускает обнаруженный сигнал. Хотя несколько доступных пар активатор-репортер позволяют использовать многоцветные приложения STORM, эта система требует двойной маркировки одного и того же антитела-мишени и зависит от близости двух флуорофоров. Микроскопия STORM без активирующего красителя, dSTORM, в настоящее время широко используется с различными красителями-репортерами, поскольку индуцированное фотопереключение достаточно эффективно при значительной мощности лазера.

Изображение: 3D STORM-изображение актина, меченного AF647-фаллоидином в клетках HACAT (клетки культуры кератиноцитов человека). Образцы предоставлены ONI Imaging. Масштабная шкала составляет 10 мкм.

Чем полезна микроскопия STORM?

С помощью стохастической визуализации небольших подмножеств флюорофоров с фотоотключением с течением времени микроскопия STORM позволяет пространственно различить локализацию отдельных молекул с высокой точностью даже в плотных популяциях. Микроскопы STORM могут создавать высококачественные изображения клеточных компонентов с разрешением до 20 нм, изменяя способ, которым ученые визуализируют молекулярные структуры, взаимодействия внутри органелл и биологические процессы.

Несмотря на то, что STORM микроскопия - превосходный метод сверхвысокого разрешения на основе локализации, его использование для получения изображений в реальном времени ограничено, главным образом из-за проблем фототоксичности. В этом случае микроскопия PALM, в которой используются различные фотоактивируемые флуорофоры, лучше подходит для визуализации в реальном времени и отслеживания отдельных частиц. Микроскопия PALM позволяет отслеживать движение молекул во времени, рассчитывать коэффициенты диффузии и описывать поведение частиц.

Почему следует рассматривать микроскоп Nanoimager для микроскопии STORM?

Микроскоп Nanoimager предлагает несколько режимов сверхвысокого разрешения для визуализации клеток или очищенных компонентов на наноразмерном уровне. Чрезвычайная чувствительность, стабильность и точность микроскопа Nanoimager делают его отличным инструментом для точных измерений с использованием микроскопии STORM и PALM. Микроскопия STORM позволит получать изображения с повышенным разрешением до 20 нм и может предоставить дополнительную информацию об изображении путем визуализации одной молекулы или кластерного анализа.

Микроскоп Nanoimager имеет четыре различных лазерных линии и предлагает возможность STORM визуализации двух флуорофоров одновременно на одном образце микроскопа, что позволяет назначать локализации одной молекулы, зарегистрированные в одном канале, клеточными маркерами во втором канале.

Микроскоп Nanoimager был использован для количественного анализа митохондрий в клетках нейробластомы и лучшего понимания сборки белкового комплекса в E.coli с помощью микроскопии dSTORM. В сочетании с TIRF-микроскопией или HILO-микроскопией Nanoimager может выполнять STORM-визуализацию в более тонких образцах с улучшенным отношением сигнал/шум, открывая ученым возможности для изучения мембранно-ассоциированных комплексов и небольших пузырьков.

Что такое микроскопия PALM?

Микроскопия PALM - это метод микроскопии сверхвысокого разрешения, а название PALM - сокращение от «Фотоактивированная локализационная микроскопия». Техника была изобретена Эриком Бетцигом вместе со своим коллегой Харальдом Хессом, и эта работа получила международное признание благодаря присуждению Нобелевской премии по химии 2014 года. Бетциг поделился наградой со Стефаном Хеллом и Уильямом Мёрнером за их вклад в прорыв дифракционного барьера при флуоресцентной микроскопии с помощью метода STED микроскопии.

Микроскопия PALM использует фотоактивируемые флуорофоры для различения пространственных деталей плотно упакованных молекул. После активации лазерами флуорофоры излучают в течение короткого периода времени, но в конечном итоге обесцвечиваются. Лазер стохастически активирует флуорофоры, пока все не испустятся. Важно отметить, что, активируя их случайным образом и в меньших количествах, можно получить более точное представление об их положениях, что делает микроскопию PALM ключевой техникой локализационной микроскопии.

Сигналы от каждого флуорофора по-прежнему подвержены дифракции света около 300 нм. Однако, поскольку каждый из них был активирован отдельно, центр масс может быть точно рассчитан. Функция разброса точек (PSF) используется для определения местоположения с разрешением до 20 нм. Путем сопоставления каждой из более точно определенных точек можно получить полное микроскопическое изображение с высоким разрешением.

Микроскопия PALM может сочетаться с микроскопией TIRF или микроскопией HILO для улучшения отношения сигнал / шум более тонкого образца. Это открывает возможности для исследователей, изучающих мембраносвязанные белковые комплексы или более мелкие везикулы.

Изображение: Отслеживание одной частицы T3SS-HALO, окрашенного JF549 в живых бактериях. Образец предоставлен доктором А. Дипольдом, Институт наземной микробиологии им. Макса Планка, Марбург, Германия. Масштабная шкала составляет 1 мкм.

Какие флуорофоры можно использовать для микроскопии PALM?

Микроскопия PALM и микроскопия STORM используют стохастическую активацию отдельных флуорофоров для различения пространственных деталей путем определения точных положений отдельных молекул. Три обычно используемых типа флуорофоров:

- Фотоактивируемые флуорофоры: в настоящее время наиболее распространенными являются фотоактивируемые белки, например, PAmCherry, PA-GFP, которые излучают свет при активации ультрафиолетовым светом;

- Фотоконвертируемые флуорофоры: флуоресцентные белки, которые изменяют свой спектр излучения при активации ультрафиолетовым светом (например, белки mEOS);

- Фотопереключаемые флуорофоры: обычно химические красители (например, Alexa Fluor 647, DyLight555), которые могут неоднократно переключаться между темными, не флуоресцентными и яркими флуоресцентными состояниями.

Флуорофоры постоянно развиваются. Новые красители часто фотоактивируются на более длинных волнах излучения, которые более благоприятны для живых образцов. В настоящее время доступны некоторые флуорофоры, которые можно фотопереключать и фотоактивировать, предоставляя дополнительные возможности для получения изображений.

Как можно использовать микроскоп PALM?

Микроскопы PALM могут быть использованы для локализационной микроскопии фиксированного образца, чтобы описать сложные детали анализируемых образцов с разрешением, достигающим 20 нм. Использование фотоактивируемых или фотоконвертируемых белков позволяет вести подсчет молекул, например, в комплексах и кластерах.

Другое приложение - отслеживание одиночных частиц в живых клетках. Стохастически активируя отдельные флуорофоры, мы можем отслеживать движение молекул во времени, вычислять коэффициенты диффузии и описывать поведение частиц.

Изображение: Отслеживание одной частицы HALO-меченного белка FtsK, связанного с лигандом TMR в клетках Mycobacterium smegmatis, образцы предоставлены лабораторией Zakrzewska-Czerwinska, Вроцлавский университет, Польша. Масштабная шкала составляет 0,5 мкм, цветовая шкала 0-6 мкм2/с.

Почему следует рассматривать микроскоп Nanoimager для микроскопии PALM?

В качестве микроскопа PALM, необычайная чувствительность, стабильность и точность микроскопа Nanoimager делают его отличным инструментом для точных измерений с использованием методов микроскопии STORM и PALM. Он способен получать изображения в четырех цветах с двумя цветами, работающими одновременно, что позволяет отслеживать два разных вида флуорофора одновременно. Это позволяет осуществлять локализацию одной молекулы и относить следы, зарегистрированные в одном канале, к клеточным маркерам во втором канале.

Лазеры с цифровым управлением обеспечивают точные воспроизводимые результаты, а с помощью камеры sCMOS можно получать изображения с разрешением до 20 нм. Это надежный микроскоп с уникальным дизайном, поэтому его можно использовать в любом помещении лаборатории, а не только на оптических столах в темных комнатах. Конструкция естественным образом гасит вибрации, поэтому становится возможным получение чистого изображения с высоким разрешением. Микроскоп Nanoimager универсален, поэтому его не следует рассматривать только как микроскоп PALM. Он также может делать dSTORM микроскопию, отслеживание одиночной частицы и smFRET.

Микроскоп Nanoimager был использован в качестве микроскопа PALM для изучения отслеживания РНК-полимеразы в E.coli, отслеживания FtsK в Mycobacterium smegmatis и мембранных комплексов в бактериях.

Что такое отслеживание одной частицы?

Отслеживание одной частицы (SPT - Single-particle tracking) является мощным инструментом в микроскопии, который позволяет отслеживать движение отдельных флуоресцентно меченных частиц (молекул, везикул, вирионов или других молекулярных комплексов) в неподвижной среде или в живых клетках и получать информацию об их динамическом поведении с течением времени.

Следы (треки) одной частицы могут помочь ученым лучше понять положения, пути и взаимодействия молекул в системах, которые являются высокодинамичными или требуют визуализации в течение длительных периодов времени. После сбора данных положения отслеживаемых частиц определяются с точностью до нанометра с использованием алгоритмов обработки изображений. Траектории также могут быть извлечены из временных последовательностей с разрешением до миллисекунд.

Почему отслеживание одной частицы полезно?

Отслеживание одной частицы использовалось для исследования широкого спектра биологических процессов, включая движение молекул (белков или ДНК) в цитоплазме и ядре, движение везикул или вирусных частиц в цитоплазме или среде, движение липидов и белков внутри мембраны или через клеточные ячейки, и поглощение внешних факторов, например, при доставке генов или лекарств. Треки одной частицы могут также выявить структурно-функциональные связи, лежащие в основе сложных систем, и помочь в создании 2D или 3D карт локализации таких систем.

Изображение: Лаборатория Zakrzewska-Czerwinska, Вроцлавский университет, Польша

 (масштабная шкала 0,5 мкм, цветовая шкала 0-6 мкм2/с)

Почему следует рассматривать микроскоп Nanoimager для отслеживания одной частицы?

Трекинг отдельных частиц в микроскопии требует высокой скорости и высокой чувствительности для достижения временного разрешения в миллисекундах. Микроскоп Nanoimager предлагает уникальную чувствительность к одной молекуле, которая делает крайне простым обнаружение флуоресцентно меченных молекул или пузырьков. Наш микроскоп использует отслеживание одной частицы для подсчета и измерения размера молекул или пузырьков в растворе.

Микроскоп Nanoimager может быть нагрет до 37 ℃ для визуализации живых клеток и имеет четыре различных лазерных линии. Это дает возможность визуализации двух флуорофоров одновременно на одном образце и позволяет назначать треки, зарегистрированные в одном канале, клеточными маркерами во втором канале. Наше программное обеспечение NimOS обеспечивает специальный анализ отслеживания и автоматическое обнаружение частиц с течением времени. Коэффициенты диффузии и измерения размера и количества частиц (для отслеживаемых частиц в растворе) суммируются мгновенно для отдельных треков или групп треков с возможностью экспорта результатов в удобном формате CSV.

Микроскоп Nanoimager использовался для визуализации везикул, содержащих белки канала TRP, транспортируемых в плазматическую мембрану, для отслеживания везикул в клетках и в растворе в 3D визуализации, а также для изучения поглощения экзосом в клетках HeLa.

Что такое одномолекулярная FRET микроскопия?

Одномолекулярная FRET микроскопия (smFRET) - это биофизический метод, который позволяет измерять расстояния между отдельными молекулами в масштабе 1-10 нанометров. FRET - это сокращение от «передача энергии резонанса Ферстера», механизм для описания переноса энергии между двумя хромофорами.

С smFRET мы используем естественное явление, которое возникает между 2 флуорофорами, называемыми донором и акцептором, когда они достигают расстояния 1-10 нм между друг другом. Энергия излучения донора передается акцептору, который впоследствии флуоресцирует в непосредственной близости. Для экспериментов FRET необходимо тщательно выбирать доноров и акцепторы, чтобы спектр излучения донора частично перекрывался со спектром поглощения акцептора.

Чем полезна одномолекулярная FRET микроскопия?

FRET флуоресценция может быть использована несколькими способами. Внутримолекулярные и межмолекулярные расстояния и стехиометрия могут быть измерены. Кроме того, можно понять частоту и продолжительность связанных событий. Данные smFRET позволяют вывести переходные конформационные изменения посредством качественной интерпретации.

Вкратце, одномолекулярная FRET микроскопия может использоваться для количественной оценки и характеристики:

- связанных событий,

- внутримолекулярных переходов и динамики,

- конкретных взаимодействий и сложных сборок,

- кинетики и времени задержки для отдельных молекул.

FRET методика была полезна во многих областях, включая сворачивание белка, изменение конформации ДНК, слияние везикул и ионные каналы.

Каковы ограничения одномолекулярной FRET микроскопии?

Точные расстояния, участвующие в передаче энергии между двумя флуорофорами при флуоресцентном событии FRET, могут варьироваться в зависимости от среды клетки и того, как ориентируются отдельные красители. Флуорофоры могут связываться с различными частями белка-хозяина нестандартным способом, и это будет влиять на флуоресценцию.

Однако для увеличения точности можно использовать усреднение населенности. Кроме того, часто для получения значительных результатов расстояние не нужно определять с абсолютной точностью. Движения отдельных молекул и время задержки все еще могут быть получены с пользой.

Почему следует рассматривать микроскоп Nanoimager для одномолекулярной FRET микроскопии?

Микроскоп Nanoimager является единственным коммерчески доступным микроскопом, способным выполнять одномолекулярную FRET микроскопию. Он поставляется с нашим программным обеспечением NimOS, которое интерпретирует данные изображений smFRET и позволяет отслеживать взаимодействия в режиме реального времени. С большим полем зрения тысячи событий флуоресценции FRET могут быть отслежены в одном кадре изображения, ускоряя процесс и повышая точность результатов. Можно построить отдельные следы FRET и рассчитать средние значения по населенности в целом.