Временное разрешение является ключом к пониманию того, как сети нейронов в мозгу обрабатывают информацию. Флуоресцентные зонды с быстрой кинетикой (GCaMP7f; Dana et al., 2019) и новые датчики напряжения (Chavarha et al., 2018) достаточно чувствительны для разрешения временных событий в микросекундном масштабе, а микроскоп FEMTO3D Atlas от Femtonics с его сверхбыстрым сканированием идет в ногу с новейшими методами. Эксперты Femtonics разработали 3D-технологию компенсации движения, которая чрезвычайно полезна для приложений in vivo, выполняемых на моделях животных со свободным поведением, во время которых даже незначительное смещение ткани может ухудшить качество сигнала. Технология 3D компенсации движения в сочетании с новыми методами сканирования, объединенными в микроскопе FEMTO3D Atlas, обеспечивает гибкое решение для сбора данных с поправкой на движение в больших объемах при высокой частоте кадров. Технология 3D компенсации движения для получения чистых данных от моделей животных со свободным поведениемПри сканировании отдельных мест в образцах тканей с помощью режима трехмерного сканирования точек произвольного доступа микроскопа Atlas временное разрешение может достигать беспрецедентных скоростей. Тем не менее, поскольку живой образец редко бывает статичным, сбор данных с одной точкой на объект (например, одна точка на дендритный шип, см. рис. 1 вверху) в нестатической ткани (модель животного в бодрствующем состоянии с фиксированной головой) даст субоптимальное отношение сигнал-шум (SNR) в записанных данных. В технологии компенсации движения в 3D применяются последние теоретические результаты, реализованные в программном обеспечении Femtonics для управления акустооптическим микроскопом, для расширения точек выборки в 3D в линию вдоль любого заданного направления (сканирование дрейфа, Szalay et al 2016, Neuron). Когда много одинаковых линий точно выровнены, плоскость произвольной формы можно сканировать в 3D (см. рис. 1, внизу). Во время эксперимента in vivo образец почти всегда демонстрирует артефакты движения из-за пульсации сосудов, дыхания или движений конечностей. Сканирование в виде лент или кубов гарантирует, что целевые элементы остаются в сканируемых областях, что значительно улучшает качество сигнала (рис. 2). |
Рисунок 1 |
Рисунок 2: 3D-технология компенсации движения в сочетании с дополнительными алгоритмическими инструментами увеличивает SNR более чем на порядок в моделях животных со свободным поведением
Гибкие режимы сканирования с технологией 3D компенсацией движения
Гибкость микроскопа FEMTO3D Atlas может служить широкому спектру приложений (таб. 3), от самого маленького пространственного масштаба — визуализации позвоночника — до экспериментов, в которых стратегии сканирования «Шахматная доска» или «Мультикуб» могут справляться с большими артефактами движения, в то время как по-прежнему дает высококачественные данные флуоресценции. Пользователи могут легко настроить режимы сканирования либо для максимизации частоты дискретизации, либо для получения данных из большого количества клеток. Функции измерения и анализа программного обеспечения управления MES обеспечивают полную гибкость при 3D-сканировании и предлагают соответствующие инструменты визуализации и выбора данных для работы со сложными структурами нейронов.
Таблица 3: Новые экспериментальные стратегии, реализованные в микроскопе FEMTO3D Atlas
Методы сканирования |
3D random access point |
3D trajectory and multiple-line |
3D RIBBON |
3D SNAKE |
3D CHESSBOARD |
3D MULTI -CUBE |
|
|
|
|
|
|
|
Скорость |
30 кГц на точку |
До 30 кГц на шипик |
до 3 кГц на дендритном сегменте длиной 50 мкм |
до 300 Гц на дендритном сегменте длиной 50 мкм |
до 3 кГц на 2D ROI |
до 300 Гц на объем |
Количество одновременно проверяемых областей |
2000 < клеток |
до 1000 шипов |
дендритный сегмент длиной до 1000 мкм |
дендритный сегмент длиной до 300 мкм |
до 300 регионов |
До 30 объемных областей |
Преимущества в нейронауках |
Трехмерное изображение сети в больших клеточных популяциях |
визуализация дендритов без перерыва и запись активности более 150 шипов |
визуализация активности в более чем 12 шиповидных дендритных сегментах |
визуализация дендритов во время движений большой амплитуды |
высокоскоростная соматическая запись, сетевая визуализация |
визуализация сомат во время движений большой амплитуды |
Пример измерения с 3D сканированием ленты
Рисунок 4: 3D-ленты, охватывающие двенадцать дендритных сегментов с шипами меченых GCaMP6 пирамидальных нейронов слоя II/III, измеренные в мозге живой мыши. Активность, вызванная зрительными стимулами, регистрировалась в 132 выбранных шипиках и визуализировалась в виде классических Са2+-транзиентов. Подробные технические сведения и сведения о применении см. в соответствующей статье: Szalay et al., Neuron, 2016 г.