Каковы преимущества аппаратного автофокуса в микроскопии?
Аппаратные системы автофокусировки чрезвычайно полезны в микроскопии особенно в биологических науках. Они могут использоваться для повышения производительности визуализации или обеспечения фокусировки образцов в течение длительного эксперимента с таймлапсом.
Они используют отражение лазерного сигнала от образца для определения его положения в пространстве, а затем автоматически регулируют ось фокусировки микроскопа (Z), чтобы вернуть образец в фокус.
Это дает им три ключевых преимущества перед решениями с автофокусом на базе камер:
- Они не зависят от контрастности образца, что означает, что флуоресцентные или неокрашенные образцы можно легче держать в фокусе.
- Захват фокуса происходит чрезвычайно быстро и в режиме реального времени, в то время как решения на основе камер требуют нескольких секунд сканирования по оси Z микроскопа.
- Аппаратные решения для автофокусировки отслеживают поверхность образца, поэтому нет необходимости предварительно определять карту фокусировки в разных точках образца.
PureFocus850 от Prior - это чрезвычайно универсальный аппаратный автофокус с многочисленными функциями, позволяющими микроскопистам, работающим в области биологических наук, использовать эти преимущества в широком спектре методов микроскопии и типов образцов. Что очень важно для микроскопии в биологических науках, PureFocus850 может отслеживать поверхность покровных стекол, сохраняя фокус на образце под ними.
Как аппаратный автофокус адаптируется к различным методам микроскопии?
Микроскопия в светлом поле
Микроскопия тонких срезов в светлом поле (диаскопическая) - это, пожалуй, самая рутинная техника микроскопии. Просто белый свет проходит через образец, и в результате изменения поглощения и рассеяния света различными элементами формируется изображение. Под «светлым полем» подразумевается почти белый фон, контрастирующий с более темными элементами образца.
PureFocus850 оснащен механизмом смещения, который позволяет поддерживать фокусировку на образце, отслеживая контролируемую поверхность покровного стекла - необходимая функция для получения изображений даже на самых стандартных предметных стеклах. Биологические образцы имеют слабую отражающую способность, поэтому PureFocus850 обнаруживает покровное стекло. Механика смещения позволяет Purefocus850 фокусироваться на покровном стекле, в то время как окуляры микроскопа или камера сфокусированы на образце.
Однако в некоторых случаях, например, при анализе клеток крови, для достаточно детального разрешения особенностей образца требуются масляные иммерсионные объективы с высоким увеличением. При этом внешняя поверхность покровного стекла не может быть использована PureFocus850, поскольку иммерсионное масло и стекло имеют очень близкие показатели преломления. Однако смещение можно отрегулировать так, чтобы вместо него можно было обнаружить внутреннюю поверхность покровного стекла.
Микроскопия в светлом поле обычно предполагает использование цветной камеры с высокой эффективностью обнаружения в видимом спектре света: лазер PureFocus850 использует инфракрасную длину волны, чтобы избежать появления сигнала лазера на изображении образца.
Микроскопия в темном поле
Микроскопия в темном поле с проходящим светом имеет множество применений в биологии. Чаще всего она используется для наблюдения за участками тканей или клеток, которые имеют низкий контраст, что делает микроскопию в светлом поле неподходящим методом наблюдения.
Темнопольная микроскопия основана на отражении или преломлении света, проходящего через образец, что позволяет собрать его в объектив. Свет, на который не влияет образец, не собирается. В результате фон становится темным (отсюда и название «темное поле»), а образцы выглядят яркими. Это, в свою очередь, позволяет наблюдать внутриклеточные детали без окрашивания образца, а также легче обнаруживать мелкие частицы или загрязнения в образце.
Поскольку PureFocus850 не полагается на контрастность для получения фокуса, часто редкий сигнал, возникающий при микроскопии в темном поле, не влияет на производительность. Темнопольная микроскопия также склонна к тому, что объекты вне плоскости образца будут ярко выделяться на изображении, и методы автофокусировки на основе камеры могут ошибочно фокусироваться на таких объектах. Поскольку PureFocus850 фокусируется только на покровном стекле, он полностью исключает эти ошибки.
Флуоресцентная микроскопия
Хотя микроскопия в темном поле может обеспечить контраст в прозрачных образцах, она не позволяет выделить специфические особенности и ограничена тем, насколько малы могут быть выделенные особенности. Флуоресцентная микроскопия, либо путем трансформации живых клеток или организмов, либо путем маркировки срезов, напротив, позволяет локализовать и идентифицировать определенные органеллы и другие субклеточные особенности.
Флуоресценция - это явление, при котором объект, обычно молекулярная метка, конъюгированная с белком в контексте микроскопии, поглощает свет на одной длине волны и излучает его на более длинной волне. Это различие между поглощенным и испущенным сигналом позволяет обнаружить свет, испускаемый исключительно флуоресцентной молекулярной меткой, если микроскоп оснащен оптикой, которая позволяет свету этой длины волны достигать детектора. В результате эти специфические особенности сильно выделяются на черном фоне.
В одном и том же образце можно получить изображение нескольких объектов с различными флуоресцентными метками. Моторизованные устройства, такие как колеса фильтров и револьверные головки, могут перемещать нужные возбуждающие фильтры (для выбора длины волны поглощения) и эмиссионные фильтры (для выбора длины волны эмиссии) в световой тракт микроскопа, и изображения делаются последовательно. Затем может быть получено составное изображение различных меток.
Области применения флуоресцентной микроскопии очень широки: от относительно простых широкопольных методов, таких как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) или высокопроизводительный скрининг, до более сложных методов микроскопии высокого класса, таких как конфокальная микроскопия с вращающимся диском и микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF).
Как правило, для флуоресцентных меток требуется возбуждающий свет в диапазоне от ближнего ультрафиолетового до дальнего красного диапазона волн. В результате любая аппаратная автофокусировка не должна создавать помех для длин волн, используемых для получения изображения. В PureFocus850 используется лазер с длиной волны 850 нм, что находится за пределами длины волны излучения Cy7, распространенной флуоресцентной метки, которая излучает в ближнем инфракрасном диапазоне. Кроме того, PureFocus850 пропускает ближний ультрафиолет и видимый свет, что позволяет размещать его между флуоресцентными оптическими компонентами и объективом. Это очень важно, так как обеспечивает полную гибкость в выборе оптических компонентов при конфигурировании флуоресцентного микроскопа.
Как можно адаптировать Purefocus850 к другим высокотехнологичным методам микроскопии?
Хотя мы рассмотрели многие из наиболее популярных методов микроскопии в биологических науках, этот список не является исчерпывающим. PureFocus850 может быть модифицирован для использования с некоторыми другими высокотехнологичными методами микроскопии, такими как многофотонная микроскопия, в которых используется средний ультрафиолетовый или инфракрасный свет и могут потребоваться специальные оптические материалы или покрытия.
Интересует PureFocus850 для вашего применения?
Если у вас есть конкретное применение, не упомянутое здесь, пожалуйста, свяжитесь с нами, чтобы обсудить ваши требования.
