Арт. Celloger Pro
Введение
Митохондрии служат основными органеллами, отвечающими за выработку энергии в клетках. В частности, митохондриальный мембранный потенциал (ММП) считается ключевым показателем функции митохондрий, поскольку он жизненно важен для производства АТФ [Zorova, Ljubava D., et al. 2018]. Поэтому измерение ММП уже давно используется в качестве маркера для оценки апоптоза, жизнеспособности клеток и общего клеточного здоровья. Более того, учитывая, что функция митохондрий играет решающую роль в таких заболеваниях, как рак, диабет и болезни мозга, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Bazhin, Arkadiy A., et al. 2020] понимание и мониторинг ММП становятся все более значимыми.
Сегодня разработано множество флуоресцентных зондов для визуализации митохондриального потенциала, включая TMRE, TMRM, JC-1, JC-10, Mito-ID, MitoTracker и др. Среди них красители JC-1 и JC-10 демонстрируют изменение длины волны флуоресценции в зависимости от формы зонда. В здоровых клетках с нормальной ММП JC-10 накапливается в митохондриях, образуя агрегаты, излучающие красную флуоресцентную волну. С другой стороны, в нездоровых клетках с пониженной ММП, таких как апоптотические клетки, JC-10 рассеивается по цитоплазме и превращается в мономеры, испуская зеленый флуоресцентный свет [Sivandzade, Farzane, et al. 2019].
Метод
Клетки HeLa высевали с плотностью 3,5 х 104 клеток на лунку в 24-луночный планшет. После ночной инкубации клетки обрабатывали карбонилцианид 3-хлорфенилгидразоном (CCCP) (Sigma, C2759-100MG) в концентрациях 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 и 20 мкМ в течение 20 минут. После промывки буфером HBSS клетки окрашивали раствором 10 мкМ JC-10 (AAT bioquest, 22204) в темноте в течение часа. Наконец, изображения были получены с помощью автоматизированной системы визуализации живых клеток Celloger® Pro с объективом 2X.
Результат
Наблюдались изменения флуоресценции в результате деполяризации с помощью красителя JC-10 и карбонилцианида 3-хлорфенилгидразона (CCCP), который действует как разобщитель окислительного фосфорилирования. Для количественного сравнения были получены изображения зеленой и красной флуоресценции с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 2X для широкого поля зрения. Затем использовалось программное обеспечение для анализа, чтобы измерить изменения интенсивности. При увеличении концентрации CCCP мембранный потенциал деполяризовался, что приводило к снижению интенсивности красного и увеличению интенсивности зеленого. (рис. 1А). Эта тенденция сохранялась до достижения концентрации 20 мкМ, при которой интенсивность красного цвета становилась практически незначительной, и клетки становились полностью зелеными. Изображения 1B, полученные с помощью микроскопа Celloger® Pro с использованием объектива 2X, позволяют наблюдать распределение красной и зеленой флуоресценции. График на рисунке 1С, изображающий соотношение интенсивности зеленого и красного цветов в зависимости от концентрации CCCP в виде точечной диаграммы, демонстрирует постепенное возрастание, подходящее для подгонки полиномиальной регрессионной кривой.
Рисунок 1. Митохондриальная дисфункция в зависимости от концентрации CCCP.
(A) Интенсивность зеленой и красной флуоресценции изменялась при различных концентрациях CCCP. (B) В контрольной группе наблюдались сильные сигналы, похожие на красные точки, в то время как клетки, обработанные CCCP, демонстрировали заметное распространение зеленой флуоресценции по всей цитоплазме. (C) Взаимосвязь между соотношением зеленого и красного цветов и концентрацией CCCP моделируется с помощью полиномиальной кривой второго порядка (R2=0,97).
Заключение
Митохондриальная активность в клетках сложным образом регулируется в ответ на внутриклеточные условия, включая такие факторы, как ММП, которые могут меняться в зависимости от стадии клеточного цикла [Hirusaki, Kotoe, et al., 2017]. Поэтому важно анализировать ее в достаточно широких областях, чтобы учесть эти изменения, но сбор изображений из нескольких областей является трудоемкой задачей. Кроме того, такие красители, как JC-10, которые отображают два цвета в зависимости от их молекулярной формы, требуют индивидуального обнаружения с использованием двух различных каналов флуоресценции. Описанные проблемы были успешно решены с помощью микроскопа Celloger Pro, который предлагает такие функции, как двухцветная флуоресценция и визуализация в светлом поле. Кроме того, он эффективно захватывает изображения из разных положений, автоматически перемещая камеру.
