Двойная эмульсия для инкапсуляции с использованием микрофлюидики

Дизайн чипа

Самодельный чип из PDMS, используемый для этого протокола, основан на опубликованной статье Petit et al, 2016. Эта конструкция имеет двойной переход, что позволяет лучше контролировать образование каждой капли (например, вода-масло, а затем вода-масло-вода, например).

Рис 1: (a) Обзор конструкции микрофлюидного чипа (Petit et al., 2016), имеющей три разных входа и один выход. (b) Характеристики чипа, (c) Изображение двойного перехода во время образования двойной эмульсии.

Покрытие поверхности для генерации двойной эмульсии

Успех производства двойной эмульсии в большой степени зависит от взаимодействия с поверхностью. Таким образом, обработка поверхности является ключевой частью процесса. Для образования двойных эмульсий вода-масло-вода чип должен быть гидрофобным в первом соединении и гидрофильным во втором.

Рис 2: (a) Схематическое изображение областей с различными требованиями к взаимодействию с поверхностью, гидрофобная с левой стороны и гидрофильная с правой стороны. (б) Изображение чипа во время обработки поверхности.

PDMS уже обладает гидрофобными свойствами, поэтому ПВС используется для превращения канала после соединения в гидрофильный. Чтобы избежать попадания ПВС в каналы, которые должны оставаться гидрофобными, во внутреннем и промежуточном каналах создается положительное давление воздуха, а на выходе создается вакуум, как показано на схемах ниже.

Рис 3: Схема микрофлюидной системы, используемой для покрытия поверхности. 

Краткое руководство по инкапсуляции с двойной эмульсией с использованием микрофлюидики

Подключение оборудования

• Подключите контроллер давления OB1 Elveflow к внешнему источнику давления с помощью пневматической трубки и к компьютеру с помощью кабеля USB.
• Включите OB1 Elveflow, нажав выключатель питания.
• Запустите ПО Elveflow.
• Нажмите "Добавить инструмент" \ выберите OB1 \ установить как MK3 +, при необходимости настройте каналы давления, дайте имя инструменту и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш контроллер OB1 теперь должен быть в списке распознанных устройств.
• При первом использовании требуется калибровка OB1.
• Откройте окно OB1.

Приготовление раствора

Протокол основан на Deshpande et al, 2018.

• Раствор для гидрофильной обработки поверхности: приготовьте 2.5% (вес / объем) раствор ПВС в воде. Поместите химический стакан с дистиллированной водой с чистой магнитной мешалкой над мешалкой с подогревом и начните перемешивание (~ 500 об / мин). Осторожно добавьте к нему соответствующий вес ПВС. Постепенно увеличивайте температуру до 85 °C и оставляйте при перемешивании, пока не исчезнут комочки ПВС (обычно около 1.5 часов). Подождите, пока раствор остынет, и отрегулируйте объем, чтобы учесть испарение.

Совет: 10 мл раствора удобно приготовить и использовать в нескольких чипах и нескольких экспериментах с течением времени. Будьте осторожны, потому что раствор ПВС подвержен загрязнению. Всегда фильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра перед хранением, чтобы избежать засорения каналов чипа.

• "Внутренний" водный раствор (IA): приготовьте 15% (об. / об.) раствор глицерина в дистиллированной воде. Хорошо перемешайте. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре до тех пор, пока нет агрегатов. В типичном эксперименте используется около 0.5 мл раствора, поэтому 10 мл раствора удобно приготовить для нескольких экспериментов.

Совет: Отрежьте кончик наконечника дозатора, чтобы облегчить дозирование вязкого глицерина. Отпустите пипетку очень медленно, чтобы дать глицерину время проникнуть в наконечник. Выпуская его в раствор, подождите, пока весь глицерин, прилипший к стенкам наконечника пипетки, не соберется на дне, и снова нажмите на пипетку. Возможно, придется повторить это несколько раз, чтобы наконечник полностью опустел.

• "Внешний" водный раствор (OA): Приготовьте 15% (об. / об.) и 0.5% (об. / об.) P188 раствор глицерина в дистиллированной воде. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре до тех пор, пока нет агрегатов. В типичном эксперименте используется около 2 мл, поэтому 20 мл раствора удобно приготовить для нескольких экспериментов.
• Исходный липидный раствор: приготовьте 10% (вес / объем) DOPC в этаноле. Выдавить соответствующее количество DOPC в хлороформе с помощью стеклянного шприца в круглодонную колбу и выпарить хлороформ в слабом потоке азота до образования липидной пленки на дне колбы. Чтобы убедиться, что весь хлороформ испарился, поместите колбу под частичный вакуум в эксикатор не менее чем на 2 часа. Добавить этанол до образования 10% (вес / объем) раствора и закрыть колбу парафильмом. Как можно лучше растворите липиды в этаноле. Перенесите раствор в стеклянный флакон, замените атмосферу флакона слабым потоком азота, закройте флакон парафильмом и оставьте его при -20 °C. Раствор можно использовать до тех пор, пока нет агрегатов или изменения цвета. 250 мкл удобно готовить и использовать в нескольких экспериментах.

Совет: Если липиды плохо растворяются в этаноле, добавьте равные части этанола и хлороформа в количестве от 5% до 10% (вес / объем). DOPC легко окисляется, поэтому не оставляйте его слишком открытым для атмосферы и как можно больше работайте с инертными газами.

• Липидно-масляный (LO) раствор: Приготовьте 6.5 мМ раствор DOPC в октаноле. Типичный эксперимент будет использовать около 150 мкл раствора LO для эксперимента на полдня и 250 мкл для эксперимента на целый день.

Совет: приготовьте этот раствор прямо перед использованием. Чтобы обеспечить правильную концентрацию липидов, наполните наконечник пипетки один раз DOPC в растворе этанола, вылейте его обратно и снова заполните.

Покрытие поверхности чипа

• Следуя схеме на рисунке 3, подсоедините 15-миллилитровую пробирку Falcon (название: ПВС), содержащую от 1 до 2 мл 2.5% раствора ПВС, к одному из вакуумных каналов OB1. Затем подсоедините пустую пробирку Falcon объемом 50 мл с 4 портами (название: воздух) к каналу 2000 мбар (для положительного давления воздуха). И, наконец, подключите пустую пробирку Falcon на 15 мл (название: выход) ко второму вакуумному каналу (тут будут отходы).

Совет: используйте пробирку Falcon на 15 мл для раствора ПВС, потому что ПВС пенится под вакуумом (применяется на этапе очистки чипа) и может легко попасть в пневматическую трубку и потенциально повредить OB1.

• Подсоедините трубки резервуара "Воздух" к входам LO и IA (входы 2 и 3), а резервуар "Выход" - к выходному отверстию.
• Установите давление 40 мбар для резервуара "Воздух" (образуется поток воздуха) и вакуум -50 мбар для резервуара "Выход".
• Установите давление 20 мбар в резервуаре "ПВС", пока раствор не начнет капать из трубки, а затем подсоедините трубку к входу OA (вход 1).
• Медленно уменьшайте давление в резервуаре "Воздух" и увеличивайте давление в резервуаре с ПВС так, чтобы ПВС равномерно покрыл весь канал пост-соединения, и дайте ему течь в течение 3-5 минут.

Совет: раствор ПВС не должен попадать в канал IA, иначе чип не сможет образовывать двойные эмульсии из-за смачивания стенок внутренним раствором. Если это произойдет, чип будет уничтожен. Хорошей практикой является создание «полумесяца» воздуха, отталкивающего ПВС от стенок внутреннего канала, как показано на рисунке 1.

• Увеличьте давление в резервуаре "Воздух" до 2000 мбар, создавая вакуум -1000 мбар как для ПВС, так и для резервуара "Выход", чтобы очистить чип от ПВС.

Совет: Для мгновенного переключения этих давлений используйте режим Editor Mode для OB1 в ПО ESI от Elveflow. Чтобы избежать попадания раствора ПВС в пневматические трубки 15 мл пробирки Falcon и потенциального повреждения OB1, отключите вакуум в этом канале и отсоедините трубку от чипа, как только внутри резервуара начнут образовываться пузырьки. Обязательно удалите из чипа весь ПВС, прежде чем отсоединять оставшиеся трубки.

• Поместите чип в печь с температурой 120 °C как минимум на 15 минут.

Генерация двойной эмульсии

• Добавьте [1,5–2] мл растворов IA и OA в две отдельные пробирки Eppendorf. Добавьте [125–250] мкл раствора LO в другую пробирку Eppendorf. Подсоедините трубку к трем пробиркам Eppendorf.
• Подключите три резервуара к соответствующему выходу контроллера давления OB1.
• Установите низкое давление (10 мбар) раствора ОА до тех пор, пока раствор не начнет капать из трубки, а затем подсоедините трубку к впускному порту 1. Заполните микрофлюидный чип раствором ОА.

Совет: Убедитесь, что трубка полностью опущена во впускное отверстие и пузырьки воздуха отсутствуют

• Повторите Шаг 2 для LO (вход 2) и IA (вход 3).

Совет: Порядок введения растворов важен, потому что раствор IA не должен касаться стенок перед раствором LO, чтобы избежать смачивания поверхности.

• Двойные эмульсии можно собирать в трубку eppendorf, подсоединенную к выпускному отверстию. Полученный раствор будет иметь две фазы: водную фазу внизу и масляную фазу вверху. Двойные эмульсии можно найти на границе фаз.

Совет: В качестве альтернативы двойные эмульсии можно собирать в другие чипы, подключенные к выходу производственного чипа, например, в камеру наблюдения. Независимо от флакона для сбора, двойным эмульсиям требуется время, потому что они плавают и обычно застревают в точке трубки для сбора с самой высокой кривизной. В конце концов, они достигают критического числа и проходят через нее, достигая желаемого места.

• Подайте давление 70 мбар для раствора OA и начните увеличивать давление раствора LO до тех пор, пока не начнут формироваться капли масла. Затем увеличивайте давление раствора IA, пока он не достигнет второго соединения. Ниже приведен пример диапазона давления для создания двойной эмульсии:

Диаметр двойной эмульсии	"Внутренняя" вода (IA)	Липидно-масляный раствор (LO)	"Внешняя" вода (OA)
80 мкм	[25 – 35] мбар	[35 -45] мбар	70 мбар

Совет: Для стабилизации производства требуется несколько минут, и вначале часто бывает, что IA смачивает поверхность и прерывает производство. Это может означать, что давление IA слишком велико по сравнению с давлением LO, поэтому небольшие изменения (от 1 до 5 мбар) в одном или другом растворе могут решить проблему. Вносите изменения очень осторожно и наблюдайте, улучшится ли стабильность производства. Когда производство идет хорошо, двойные эмульсии могут формироваться до тех пор, пока не закончатся растворы (обычно ОА заканчивается первым).

Результаты получения двойных эмульсий

Полученные двойные эмульсии были протестированы на монодисперсность, эффективность инкапсуляции и стабильность во времени.

Двойные эмульсии были высоко монодисперсными (CV ~ 5%) и продемонстрировали эффективность инкапсуляции более 80%, как показано на рисунке 4. Анализы стабильности показывают, что около 50% эмульсий остаются стабильными после 5 дней при комнатной температуре, как показано на рисунке 5.

Рисунок 4: Эффективность инкапсуляции. Двойные эмульсии с промежуточной фазой, окрашенной DiI, липид-специфическим флуоресцентным красителем (красный, а), инкапсулированным кальцеином (зеленый, б). c) Двойные эмульсии, инкапсулирующие липосомы (POPC, 100 нм), окрашенные DiI.

Рисунок 5: Стабильность при комнатной температуре. Процент оставшихся двойных эмульсий и STDEV размера с течением времени при комнатной температуре. Двойные эмульсии остаются стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 72 часов, при этом более 50% из них все еще присутствуют через 5 дней. Оранжевая линия, радиус двойных эмульсий в мкм.

Эта инструкция по применению успешно продемонстрировала воспроизводимое производство стабильных двойных эмульсий с использованием капельной микрофлюидной технологии и инструментов Elveflow.

Двойные эмульсии высоко монодисперсны, обладают высокой эффективностью инкапсуляции груза и остаются стабильными после нескольких дней при физиологической температуре, что устраняет ограничения стандартных методов генерации эмульсий, такие как отсутствие воспроизводимости, высокий расход реагентов и низкая эффективность инкапсуляции.