Сборка липосом под действием октанола (OLA) с использованием оборудования Elveflow

Введение в изучение липосом и методов сборки

Липосомы — это микроскопические водные компартменты, ограниченные липидным бислоем, который отделяет их от окружающей водной среды. За прошедшие годы липосомы стали важным и универсальным инструментом в науке, медицине и промышленности; неполный список применений включает:

• минималистичную модельную систему живых клеток;
• биореакторы с диффузионным транспортом через мембраны;
• эффективные носители для доставки лекарств и генов;
• аналитические инструменты в иммуноанализе и биосенсорах.

Для производства липосом широко использовались объемные методы, включая гидратацию, экструзию и электроформование, но эти подходы ограничены высокой полидисперсностью по размеру, низкой эффективностью инкапсуляции и жесткими условиями работы над ключевыми параметрами, такими как состав липидов и содержание соли.

В последнее десятилетие появилось множество микрофлюидных методов, использующих гидродинамику в микромасштабе для получения липосом в высококонтролируемой и воспроизводимой форме. Здесь мы демонстрируем надежную микрофлюидную технику - сборку липосом с помощью октанола (OLA) [Deshpande, S., et al., 2016; Deshpande, S. , C. Dekker, 2018] - для формирования униламеллярных, монодисперсных липосом размером с клетку. Подобно процессу выдувания пузырьков, OLA значительно облегчается благодаря точному контролю над скоростью потока с помощью контроллера микрожидкостного потока компании Elveflow.

Принцип сборки липосом OLA

Управляя тремя различными потоками жидкости с помощью контроллера микрожидкостного потока, OLA происходит на шестиходовом переходе в лаборатории на кристалле. Как видно на этапе I рис. 1, стабильные и монодисперсные капли двойной эмульсии образуются за один шаг. После формирования фаза LO распределяется асимметрично по поверхности, образуя, с одной стороны, отчетливый объем в форме полумесяца (рис. 1, этап II).

Рисунок 1. Сборка липосом под действием октанола (OLA). (a) Схема, показывающая принцип работы OLA для получения липосом на чипе. Шаг I: IA и окружающая фаза LO гидродинамически фокусируются и затем отжимаются двумя потоками OA, образуя каплю двойной эмульсии. Шаг II: липидный бислой начинает собираться вдоль границы раздела фаз, а молекулы 1-октанола вместе с избытком липидов образуют заметный карман. Шаг III: 1-октаноловый карман спонтанно отделяется, образуя полностью собранную униламеллярную липосому. (b) Соответствующие флуоресцентные изображения, показывающие каждый из описанных выше этапов. (c) Последовательности с временным разрешением, показывающие отделение капли 1-октанола с образованием липосомы. Рисунок взят из [Deshpande, S., et al., 2016].

В результате уже через несколько секунд после образования двухэмульсионная капля превращается в промежуточный комплекс, содержащий две различные фазы: выделяющийся карман 1-октанола (содержащий избыток липидов) и внутренний водный просвет, окруженный липидным бислоем.

С течением времени 1-октаноловый карман продолжает выступать наружу, площадь межфазной поверхности между инкапсулированной внутренней водной фазой и карманом постоянно уменьшается, и через несколько минут 1-октаноловая капля полностью отделяется, образуя полностью собранную липосому (рис. 1, этап III). По сравнению с традиционными методами, липосомы, полученные с помощью OLA, имеют равномерное и контролируемое распределение по размерам (рис. 2).

Рисунок 2. Липосомы, полученные по технологии OLA.

Используемое оборудование

• Контроллер микрожидкостного потока OB1 с тремя каналами 0/2000 мбар;
• 1 х Комплект стартового набора Luer Lock;
• 4 держателя трубок;
• Микрофлюидный чип;
• Микроскоп ZEISS Axio Observer и программное обеспечение ZEN 3.4;
• Цифровая камера Hamamatsu EM-CCD.

Преимущества сборки липосом OLA

OLA — это эффективная микрофлюидная техника для формирования униламеллярных, монодисперсных липосом размером с клетку. Основными преимуществами являются:

• регулируемый размер липосом благодаря точному контролю входного давления (мы регулярно делаем липосомы диаметром 10 мкм);
• работает для широкого спектра липидов, диапазона pH и ионной силы;
• обходится без трудоемких этапов экстракции растворителем и полагается на физическое обезвоживание, которое часто завершается в течение минуты;

Взгляд на OLA в платформе для микрофлюидики

Рисунок 3. Схемы микрофлюидики и системы чипов.

Видео 1. Демонстрация способности OLA эффективно производить монодисперсные образцы высокопроизводительным способом и с превосходной инкапсуляцией. Внутренняя аквафаза была окрашена желтым флуоресцентным белком. Средняя водная фаза окрашивалась смесью DOPC и Lis Rhod PE в соотношении 1000:1. Длина волны возбуждения составляла 488.

Заключение

Для стабильного производства униламеллярных, монодисперсных липосом размером с клетку мы используем высокочувствительный контроллер микрожидкостного потока Elveflow. Размер липосомы, а также состав мембраны и инкапсулированного раствора можно регулировать в широких пределах. Технология OLA предоставляет универсальный инструмент в науке, особенно в синтетической биологии, для создания клеточно-подобных объектов из отдельных компонентов, понимания клеточных модулей и создания синтетических клеток с различными функциональными возможностями [Deshpande, S., et al., 2018, 2019; Last, M.G.F., 2020].