Сочетание микрофлюидики и микроскопии
Создание адаптируемой системы для задач визуализации
Чтобы идти в ногу с текущими и будущими потребностями исследователей, основные производители систем визуализации во всем мире стремятся повысить автоматизацию и взаимосвязь устройств, чтобы исследователи могли регистрировать все более широкий диапазон динамических клеточных процессов. Чтобы облегчить переход к более совершенным системам визуализации, поставщики оборудования создают коллаборации - работая как с клиентами, так и с другими поставщиками, над разработкой новых решений и систем, отвечающих меняющимся потребностям исследователей.
Именно в этом духе сотрудничества д-р Кай Шлейхер, специалист по передовой микроскопии в центре Biozentrum Imaging Core в Университете Базеля, д-р Себастьен Петер, специалист по продажам в Olympus, и компания Elveflow, специализирующаяся на микрофлюидных системах, собрались вместе, чтобы создать решение, которое позволяет координировать конфокальную визуализацию и управление микрофлюидным потоком с помощью программного обеспечения для визуализации cellSens от Olympus. Эта система не только обеспечивает возможность визуализации клеток в условиях перфузии, но и поддерживает быстрое и точное управление жидкостью - решающее преимущество для экспериментов, использующих медикаменты или замену буфера.
Введение
В данное статье мы обсудим, как объединить и синхронизировать перфузию жидкости и визуализацию с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском Olympus с микрофлюидной системой Elveflow с управляемым давлением потоком. Первоначальная мотивация к созданию такой системы проистекает из потребности исследователей различных областей биологии и химии синхронизировать работу с жидкостью и визуализацию во время эксперимента. Для биологов это означает возможность промывать перфузионную камеру и координировать данный процесс со сбором данных с помощью микроскопа Olympus.
Фото установки, позволяющей синхронизировать работу с жидкостью и визуализацию во время эксперимента
Разработка такой микроскопической установки с регулируемым потоком позволит исследователям иметь полный и одновременный контроль над получением изображений и своим экспериментом. Эта платформа была разработана в центре, специализирующемся на вопросах визуализации, где множество пользователей с разным опытом используют инструменты для проведения своих исследований. У большинства пользователей, использующих такую систему, нет времени на разработку и конструирование платформ для проведения своих экспериментов. Поэтому второй задачей коллаборации Elveflow было сделать установку доступной, гибкой, надежной и простой в использовании, чтобы обеспечить высокую воспроизводимость и универсальность экспериментов.
Применения
Подробный экспериментальный протокол, представленный ниже, может быть использован для таких приложений, как:
- Исследование лекарств;
- Изучение антибиотикорезистентности;
- Долговременные эксперименты с перфузией;
- Динамическое культивирование с использованием нескольких сред;
- Использование нескольких буферов с разным давлением для управления смешиванием.
Принцип работы сдвоенной системы "Микроскоп+микрофлюидика"
Контроллер Elveflow OB1, использующий давление для управления потоком, был выбран среди других систем управления, доступных на рынке, потому что он может быть подключен к контроллеру реального времени RTC микроскопа Olympus через кабель BNC (миниатюрный радиочастотный разъем для быстрого подключения / отключения, используемый для коаксиального кабеля) и порты TTL (транзистор-транзисторная логика, тип последовательного интерфейса) для отправки сигналов запуска.
Фактически, контроллер потока OB1 «отправляет» или «слушает» сигнал, излучаемый или принимаемый через порт запуска, и действует соответственно на основе сигнала триггера, отправленного программным обеспечением для сбора данных микроскопа.
Фото установки, позволяющей синхронизировать работу с жидкостью и визуализацию во время эксперимента
Набор действий, запускаемых при приеме сигнала, был предварительно задан в программном обеспечении ESI с помощью планировщика. Набор действий, также называемый «последовательностью», можно легко задать и сохранить в шаблон в программном обеспечении ESI. В этой статье будут представлены три шаблона, разработанные доктором Каем Шлейхером и доктором Себастьяном Петером.
|
Немного цифр Триггер: • Триггер работает путем отправки и получения «высокого» и «низкого» напряжения от 0 до 5 В. Состояния "высокого" и "низкого" напряжения Olympus SpinSR (при подаче сигнала) • Контроллер реального времени Olympus: Высокое = 0 В (по умолчанию); • Контроллер реального времени Olympus: Низкое = 5 В. Состояния "высокого" и "низкого" напряжения на контроллере Elveflow: • Контроллер OB1 Elveflow, EXT TRIG: Высокое = 3.4 В; • Контроллер OB1 Elveflow, EXT TRIG: Низкое = 0 В (по умолчанию). Совет: Значения напряжения, заданные для определения высокого и низкого уровня сигнала, зависят от устройства (микроскопа). Таким образом, рекомендуется сначала проверить с помощью вольтметра соответствующие «Высокое» и «Низкое» напряжения. При отправке сигнала всегда используйте импульс, чтобы устройство вернулось в состояние по умолчанию. Время завершения настройки: 0.5 дня |
Контроллер реального времени (RTC) микроскопа Olympus, подключенный через кабели BNC |
Схема установки "микроскоп+микрофлюидика"
Материалы
|
Оборудование 1. Контроллер OB1 с двумя каналами 0/2000 мбар; 2. Набор фитингов с фиксатором Люэра; 3. Резервуары; 4. Микрофлюидный чип; 5. Конфокальный микроскоп с вращающимся диском Olympus IXplore SpinSR и контроллер реального времени (RTCE) + программное обеспечение Olympus Cellsens; 6. Быстрая камера для регистрации (опция); 7. Кабели BNC "папа-папа". Примечание: контроллер реального времени Olympus может как отправлять, так и принимать сигнал через один и тот же порт. Дополнительно: вольтметр с гнездовым адаптером BNC (например, цифровой мультиметр от CEN-TECH). |
Резервуар, соединенный с контролером OB1 трубкой, содержащий раствор для ввода в микрофлюидный чип |
|
TTL порты контроллера OB1 |
Подключение трубка к контроллеру OB1 |
Как запустить контроллер потока Elveflow с помощью программного обеспечения микроскопа CellSens?
Краткое руководство пользователя
Подключение прибора
- Подключите контроллер давления OB1 Elveflow к внешнему источнику давления с помощью пневматической трубки и к компьютеру с помощью кабеля USB. Короткий конец черной трубки входит в «вход давления» в контроллере OB1, длинный конец - в «выход давления» воздушного компрессора. Подключите блоки питания для контроллера OB1 и воздушного компрессора.
- Порт BNC INT: получает сигналы подключения к цифровому порту ввода / вывода контроллера Olympus (RTC), например, 1 (можно выбрать любой из 4 доступных портов);
- Порт BNC EXT: отправляет сигналы подключения к цифровому порту ввода / вывода контроллера Olympus, например, 2;
- Нажмите "Добавить инструмент \ выберите OB1 \ установить как MK3 +", при необходимости настройте каналы давления, дайте имя инструменту и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш контроллер OB1 теперь должен быть в списке распознанных устройств.
- Для первого использования требуется калибровка контроллера OB1.
- Подключите USB к компьютеру, управляющему микроскопом.
- Запустите микроскоп, компьютер и ПО CellSens.
- Запустите ПО Elveflow.
- Включите контроллер Elveflow OB1, нажав выключатель питания.
- Откройте окно OB1: в программе Elveflow загрузите последовательность по вашему выбору (см. ниже).
- В CellSens загрузите соответствующий план эксперимента (см. ниже).
- Выберите шаблон (последовательность Elveflow + план эксперимента Cellsens).
- Чтобы провести эксперимент: сначала запустите последовательность Elveflow. Затем, запустите сбор данных в CellSens.
Задание шаблона
Этот раздел проведет вас через шаги, необходимые для создания шаблона, содержащего действия, образующие последовательность, которую будет выполнять программное обеспечение ESI автоматически. Например, если Вы хотите ввести последовательно и автоматически три разных раствора в микрофлюидный чип, и Вы хотите ввести растворы / среды / реагенты при разном давлении или с разной скоростью потока, как описано ниже:
- Канал 1: давление 40 мбар на 1 час;
- Канал 2: давление 1000 мбар на 5 минут (чтобы как можно быстрее заменить предыдущую среду);
- Канал 2: давление 40 мбар на 1 час;
- Канал 3: давление 1000 мбар на 5 минут (чтобы как можно быстрее заменить предыдущую среду)
- Канал 3: давление 40 мбар на 1 час.
Чтобы перенести следующие действия в шаблон, а также создать и автоматизировать последовательность, необходимы следующие шаги:
- Запустите ПО ESI.
- Откройте панель Sequencer.
Интерфейс ПО ESI Elveflow
- Вы можете создать последовательность с нуля с помощью набора инструментов на левой панели или загрузить шаблон, описывающий предварительно созданную последовательность.
Интерфейс программного обеспечения ESI с окном Sequencer
- Чтобы создать последовательность с нуля, Вы можете задать набор действий, которые Вы хотите подключить в режиме реального времени, непосредственно через главную панель OB1.
Интерфейс программного обеспечения ESI с окном Sequencer
- Первый вариант - использовать левую панель, чтобы задать конфигурацию напрямую, щелкнув на «OB1», затем определив канал и желаемое давление и сохранив ее соответственно, как показано на рисунке выше.
- Второй вариант - создать набор действий «в реальном времени»: на главной панели OB1 вы можете отредактировать, например, условия давления OB1 (постоянное давление 40 мбар, как показано на рисунке ниже) и сохранить его, нажав «Config» в левом верхнем углу окна и «Сохранить как». Используйте понятное имя для файла (например: 40 мбар). Точно так же для второго давления (1000 мбар), необходимого в последовательности, сохраните его как «1000 мбар».
Интерфейс программного обеспечения ESI: панель / окно OB1
- Для соединения различных шагов, предварительно сохраненных, используйте левую панель, как показано выше, чтобы задать время для каждого шага, выбранный на каждом шаге инструмент, чтобы задать переключение между клапанами и соответствующими растворами ... Вы можете продолжать добавлять шаги в соответствии со своей стратегией, которую вы определили для своего эксперимента. В этом примере полная последовательность должна выглядеть, как показано на рисунке ниже:
Интерфейс программного обеспечения ESI: окно Sequencer
- Чтобы завершить набор действий, рекомендуется добавить конфигурацию с давлением OB1, установленным на 0 мбар, чтобы легко завершить эксперименты, в дополнение к этапу «END», как показано на рисунке выше.
- Когда Вы будете удовлетворены последовательностью, убедитесь, что Вы сохранили ее с помощью кнопки «Сохранить». Обратите внимание, что созданная Вами последовательность зависит от оборудования, что означает, что Вы не можете повторно использовать или загрузить ту же последовательность в другой прибор OB1. Вам придется воссоздать ее с нуля на другом инструменте.
- Чтобы протестировать последовательность, которую Вы создали и сохранили, Вы можете использовать кнопку «Play», чтобы убедиться, что ваша последовательность задана правильно.
- Чтобы запустить последовательность, загрузите ранее сохраненный шаблон.
Выбор шаблона
Для описанной коллаборации были созданы три шаблона на основе Elveflow Sequencer и CellSens:
Шаблон 1: Cellsens Elveflow (Старт)
- Состояние триггера контроллера реального времени Olympus по умолчанию – "высокое".
- Elveflow каждые 10 мс постоянно "прослушивает" вход триггера INT до тех пор, пока его значение не станет "высоким";
- Когда Cellsens отправляет «низкий» импульс, контроллер Elveflow выполняет следующую последовательность, как описано на следующем снимке экрана.
-
Запустить заданную пользователем схему немедленно (например, канал 1, 500 мбар);
-
Запустить схему на заданное пользователем время;
-
Загрузить схему, закрывающий все каналы насосной системы;
-
Конец процесса
Конфигурация 1 комбинации диспетчера экспериментов Olympus CellSens и планировщика последовательности Elveflow ESI для выполнения последовательности «Старт», известной как однократная инжекция жидкости при определенном давлении, управляемая программным обеспечением ESI (здесь 1500 мбар).
Шаблон 2: CellSens & Elveflow (Старт/Стоп)
- Состояние триггера контроллера реального времени Olympus имеет по умолчанию значение "высокое";
- Elveflow каждые 10 мс бесконечно прослушивает свой вход триггера INT до тех пор, пока его значение не станет "высоким";
- Когда CellSens отправляет «низкий» импульс, контроллер Elveflow немедленно запускает схему, заданную пользователем (например, канал 1, 100 мбар), а затем бесконечно каждые 10 мс прослушивает свой вход триггера INT до тех пор, пока его значение не станет "высоким";
- Когда Cellsens снова отправляет сигнал «низкий», контроллер Elveflow загружает схему, которая закрывает все каналы в насосной системе, а затем завершает работу.
Конфигурация 2 комбинации Olympus CellSens Experiment Manager и планировщика последовательности Elveflow ESI для выполнения последовательности «СТАРТ / СТОП», известной как однократная инжекция жидкости при определенном давлении, контролируемом программным обеспечением ESI (здесь 1500 мбар) на определенную продолжительность и последующую остановку.
Шаблон 3: Elveflow & CellSens (Старт/Обратная связь)
- Состояние триггера контроллера реального времени Olympus по умолчанию - Высокое.
- Elveflow каждые 10 мс бесконечно прослушивает свой вход триггера INT до тех пор, пока его значение не станет "высоким";
- Когда Cellsens отправляет «низкий» импульс, контроллер Elveflow немедленно запускает схему, заданную пользователем (например, канал 1, 500 мбар), затем запускает схему в течение заданного пользователем периода времени, затем загружает схему, которая закрывает все каналы на насосной системе, отправляет импульс «High» (100 мс) через порт EXT TRIG в Cellsens, затем завершает работу.
Примечание: По умолчанию порт EXT TRIG контроллера Elveflow OB1 имеет "низкое" значение (0 В).
Конфигурация 3 комбинации Olympus CellSens Experiment Manager и планировщика последовательности ELveflow ESI для выполнения последовательности «СТАРТ / ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ», известной как однократная инжекция жидкости при определенном давлении, управляемом программным обеспечением ESI (здесь 1500 мбар).
