Введение
Микрофлюидный чип (Fluidic 688) для межклеточных взаимодействий позволяет совместно культивировать различные типы клеток в отдельных, но взаимосвязанных камерах. Совместное культивирование различных типов клеток является важным шагом на пути к повышению физиологической релевантности для in vitro моделей физиологии и болезней. Сети сосудов соединяют все системы органов, транспортируя биомолекулы из одного места в другое, передавая сигнальные каскады, участвуя в экспрессии и регуляции генов, гомеостазе тканей, иммунном ответе и прогрессировании заболеваний.
В приведенном протоколе компания Elveflow, производитель оборудрвания для микрофлюидики, описывает, как заполнить отдельные камеры миколфлюидного чипа Fluidic 688 различными типами клеток и контролировать скорость потока через чип для динамической среды культивирования клеток. Клетки предварительно окрашены, чтобы проиллюстрировать закономерности разделения клеток в двух камерах во время посева.
Возможные применения
Совместное культивирование различных типов клеток в соединенных между собой камерах можно использовать для изучения:
Растворимого фактора:
- кондиционирование среды в камере B с помощью факторов, секретируемых клетками в камере A;
- "секретом" клеток – факторы роста, цитокины, хемокины;
- модели васкуляризации опухолей;
- молекулярные градиенты для анализов хемотаксиса и миграции клеток;
- иммунный ответ и заживление ран.
Совокупности нескольких органов:
- Модели нескольких органов на чипе;
- фаромокинетическое/ фармодинамическое тестирование лекарств (ADMET – абсорбция лекарств, распределение, метаболизм, экскреция, токсичность).
Физиологически значимых масштабов расстояний:
- системы клеточных сигналов и взаимодействие клеток на расстоянии.
Микрофлюидная установка для исследования межклеточных взаимодействий
Микрофлюидный чип Fluidic 688 |
Оборудование:- Контроллер потока OB1 с как минимум 1 каналом (0/2000 мбар); - Детектор скорости MFS3 (2.4-80 мкл/мин); - Стартовый набор фитингов с фиксаторов Люэра; - Емкость Falcon на 15 мл; - Микрофлюидный чип (Fluidic 688 с набором мини-соединений типа Люэр и силиконовыми трубками от microfluidic ChipShop); - Водяная баня с подогревом; - CO2 инкубатор; - Микроскоп. |
Реагенты:- Клетки типа 1: MCF7 (3×106 клеток/мл) - Клетки типа 2: HEK293 (3×106 клеток/мл) - Среда: DMEM высоким содержанием глюкозы (c фетальной бычьей сывороткой, 10%; пенициллин/ стрептомицин, 100 ед./мл; 100 мкг/мл); - Буферы / красители: PBS / красители клеток (Calcein AM, 2 мкM; Hoechst 33342, 10 мкг/мл). |
Конструкция микрофлюидных чипов для исследования межклеточных взаимодействий
Микрофлюидный чип для исследования взаимодействия клеток обеспечивает поток различных жидкостей через набор двойных портов на каждом конце чипа (2 и 3; 4 и 5). Варианты управления потоком для нескольких жидкостей включают (i) дублирование конфигурации, описанной ниже, (ii) добавление гидрораспределителя MUX для управления переключением между n x 12 различными жидкостями и (iii) добавление клапана для закачки небольших объемов реагента.
Геометрические характеристики
Две камеры объемом 37.8 мкл; шесть портов Mini Luer, по три на каждом конце, в том числе два, подключенных к длинным каналам для первоначального заполнения / посева (1 и 6), и четыре, подключенных к коротким каналам для проточной среды или ввода реагентов.
Характеристики чипа
Параметры |
Значения |
Тип интерфейса |
Mini Luer |
Объем камеры |
37.8 мкл |
Глубина камеры |
400 мкм |
Толщина крышки |
125 мкм |
Материал |
PS |
Обработка поверхности |
Гидрофилизированная |
Подготовка чипа
Обработка поверхности: «гидрофилизация» способствует прикреплению клеток к поверхности чипа (аналогично оборудованию для культивирования клеток, "обработанному тканевой культурой"). Для прикрепления клеток не требуется дополнительной обработки поверхности, хотя дополнительное покрытие может помочь в зависимости от типа клеток.
Работа с чипом: чип можно закрепить в чашке Петри, чтобы обеспечить стабильность при подсоединении трубок.
Разъемы: Порты Mini Luer подходят для микрофлюидных мини-люэровских разъемов и вилок ChipShop. Трубку (внешний диаметр 1/16 дюйма) можно присоединить к разъемам Mini Luer через короткую силиконовую муфту.
Краткое руководство по настройке микрофлюидной установки
Подготовка клеток
Следуя стандартным протоколам: Трипсинизируйте клетки из колбы для культивирования. Удалите трипсин. Тщательно подсчитайте и подготовьте исходную суспензию 3 × 106 клеток / мл для посева.
Совет: Стремитесь к заселенности на уровне >70% во время посева и сливающемуся монослою перед перфузией.
Общая процедура заполнения жидкостью
- Чтобы заполнить камеру A, надежно закройте все порты на противоположном конце чипа (т.е. 4–6) заглушками Mini Luer. Это похоже на блокировку конца пустой соломинки пальцем перед тем, как вставить ее в напиток. Воздух останется на месте и предотвратит заполнение камеры B жидкостью.
- Заполните камеру A через порт 1 с помощью пипетки (опция: рассмотрите возможность использования адаптера для пипеток Mini Luer) или с помощью контроллера давления. Оба порта 2 и 3 можно оставить открытыми. При использовании наконечника пипетки убедитесь, что он вставлен перпендикулярно в порт Mini Luer.
- После заполнения аккуратно откройте порт 6, затем закройте порты 1–3 заглушками Mini Luer.
- Чтобы заполнить камеру B, осторожно снимите заглушки с портов 4 и 5.
Совет: Важно очень осторожно вставлять и извлекать заглушки Mini Luer, чтобы минимально нарушить поток жидкости в противоположной камере.
- Заполните камеру B через впускное отверстие 6.
|
Посев клеток в чипе
- Следуя общей процедуре заполнения жидкостью: заполните камеру A клетками типа A (маточный раствор 3 x106 клеток / мл, ~ 113 400 клеток на камеру) и камеру B клетками типа B (маточный раствор 3 x106 клеток / мл). После каждого добавления клеток проверяйте поток клеток в канал с помощью микроскопа.
Совет: Поместите чип в инкубатор на 30-60 минут между посевами камер A и B, чтобы уменьшить вероятность межкамерного перемешивания, то есть после посева клеток в камере A инкубируйте чип 30-60 минут, затем осуществите посев в камере B.
- Поместите микрофлюидный чип в CO2 инкубатор на 6 – 24 часа, чтобы клетки прикрепились в статических условиях.
Совет: Чтобы канал не высыхал, осторожно закройте все порты, чтобы свести к минимуму испарение, поместите чип в чашку Петри вместе с небольшим резервуаром с водой, например, крышка пробирки на 50 мл и накройте.
- Осторожно меняйте среду вручную с помощью пипетки 1-2 раза в сутки в камерах A и B по отдельности, следуя «Общей процедуре заполнения жидкостью».
Совет: Небольшой объем раствора / суспензии клеток может перетекать через соединительную перемычку в конус противоположной камеры или вдоль стенок камеры (вдоль которых идет узкий желоб) при изменении положения заглушек во время последовательного заполнения отдельных камер.
- Опция: Чтобы улучшить разделение клеток: как только клетки в камере А будут хорошо прикреплены, очень осторожно промойте камеру А средой через отверстие для посевного материала перед сменой заглушек для посева в камере B. Большая часть межкамерного движения происходит под давлением вставки или извлечения заглушек. Рассмотрите возможность инкубации до 12 часов между посевами в камерах A и B, в зависимости от эксперимента.
Подключение оборудования для межклеточных взаимодействий
- Подключите контроллер давления OB1 к внешнему источнику давления, используя пневматическую трубку, и к компьютеру через USB кабель. Для детальных инструкций по настройке контроллера OB1 смотрите руководство пользователя.
- Подключите детекторы скорости потока к контроллеру OB1. Подробнее читайте в руководстве.
- Включите контроллер OB1, нажав переключатель питания.
- Запустите ПО Elveflow. Основные функции и опции умного интерфейса ПО Elveflow описаны в руководстве пользователя.
- Нажмите Добавить прибор \ выберите OB1 \ настроить как MK3+, задайте давление каналов, если необходимо, дайте прибору имя и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Теперь контроллер OB1 должен быть в списке распознанных устройств.
- Перед первым использование OB1 требует калибровки.
- Добавьте детекторы скорости потока: нажмите Добавить датчик \ выберете датчик потока \ аналоговый или цифровой (выберете рабочий диапазон скорости потока для датчика, если у он аналоговый), дайте датчику имя, выберете к какому прибору и каналу подключен датчик и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш датчик скорости потока должен быть в списке распознанных устройств.
- Откройте окно OB1.
Продув системы
- Заполните резервуар для образца средой и подсоедините прилагаемую трубку с внешним диаметром 1/16 дюйма и гибкую трубку с внешним диаметром 4 мм к резервуару.
- Подключите резервуар к соответствующему выходу контроллера давления OB1.
- Подсоедините прилагаемую трубку с внешним диаметром 1/16 дюйма с помощью фитинга 1/4 ”-28 от резервуара со средой к ловушке для пузырьков.
- Для измерения скорости потока подключите датчик между ловушкой для пузырьков и микрофлюидным чипом.
- Для точной настройки системы и получения наилучших характеристик с точки зрения управления скоростью потока добавьте трубку сопротивления (длина 15 см при внутреннем диаметре 100 мкм) к выходному отверстию датчика скорости потока.
Совет: Сопротивление всегда следует размещать после MFS (между MFS и микрофлюидным чипом), чтобы обеспечить стабильное измерение.
- Поместите открытый конец трубки, идущей от датчика потока, над емкостью для сбора отходов.
- Подайте давление в резервуар для жидкости и ждите пока жидкость не начнет капать из выхода.
Перфузия через микрофлюидный чип
- После того, как клетки будут хорошо прикреплены в статических условиях, выберите порты для пропускания потока, например, порт 3 как вход для жидкости и порт 4 как выход для жидкости. Снимите заглушки с этих портов и убедитесь, что остальные заглушки в остальных портах надежно закреплены.
- Убедитесь, что микрофлюидный чип полностью заполнен и что из впускного и выпускного отверстий выходит большая капля жидкости.
- Добавьте силиконовую муфту и соединитель Mini Luer к трубке, идущей от датчика скорости потока к части трубки, идущей к емкости сбора жидкости.
- Задайте низкое давление (или скорость потока) из резервуара для жидкости, пока на выходе из разъема Mini Luer не появится капля жидкости.
Совет: Держите разъем вверх, чтобы удалить весь воздух.
- Подсоедините и надёжно закрепите трубку к впускному отверстию микрофлюидного чипа (т. е. к порту 3).
- Подсоедините и надёжно закрепите выпускную трубку к выпускному отверстию микрофлюидного чипа (т. е. к порту 4).
- Установите давление (или скорость потока), чтобы начать перфузию среды в соединенные между собой камеры и начать межклеточные взаимодействия.
Совет: профиль потока может быть постоянным, пульсирующим или кастомизированным.
|
Разделение клеток по камерам A и B
Камера A: посев MCF7 (окрышены Calcein AM)
Камера B: посев HEK293 (окрашены Hoechst 33342)
Камера A
Камера A, засеянная клетками MCF7 (окрашены кальцеином, зеленый цвет). A.) Инфильтрация клеток HEK293 (Hoechst 33342, синий) на 3 мм в камеру A от центрального конуса (масштаб 500 мкм). B.) Изображение клеток в камере A в светлом поле, объединенное с флуоресцентным изображением клеток HEK293 (синий) в самой дальней точке проникновения в камеру A (вставка из панели A; масштаб 100 мкм). C.) Изображение B, объединенное с флуоресцентным изображением клеток MCF7 (кальцеин AM, зеленый; масштаб 100 мкм).
Камера B
Камера B, засеянная клетками HEK293 (окраска Hoechst, синий). A.) Все клетки в позиции (i) чипа (красная вставка) относятся к HEK293. Клетки MCF7 проникли в камеру B вдоль нижней стенки (~ 20% клеток в позиции (ii) в чипе).