Измерение параметров молекулярной среды
Время жизни флуоресценции большинства флуорофоров более или менее зависит от молекулярной среды. Поэтому визуализацию времени жизни флуоресценции (FLIM – Fluorescence Lifetime Imaging) можно использовать для измерения локальных параметров окружающей среды, таких как уровень кислотности pH, концентрация кислорода, концентрация физиологически важных ионов, связывание с РНК, ДНК, белками или липидами, локальная вязкость и локальный показатель преломления. По сравнению с методами, основанными на измерении интенсивности излучения, измерение времени жизни флуоресценции имеет то преимущество, что результат не связан с концентрацией, возможным поглощением в образце, интенсивностью излучения лазера, фокусировкой, усилением фотодетектора и другими инструментальными эффектами. Несколько примеров описаны ниже.
Визуализация уровня кислотности рН
Рис. 1. Прижизненное изображение ткани кожи, окрашенной BCECF. Время жизни является показателем уровня кислотности рН. Справа: кривые затухания флуоресценции в области низкого рН (вверху) и высокого рН (внизу)
Микроскопическая визуализация уровня кислотности pH с помощью FLIM может быть достигнута путем окрашивания образца с помощью pH-чувствительного флуоресцентного зонда. Эти зонды обычно имеют протонированную и депротонированную форму. Существует равновесие между обеими формами, которое зависит от рН местной среды. Если обе формы имеют различное время жизни флуоресценции, среднее время жизни является прямым показателем рН. Типичным представителем рН-чувствительных красителей является 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -карбоксифлуоресцеин (BCECF).
Визуализация кальция
Ионы Ca2+ участвуют в большом количестве клеточных функций, таких как внутриклеточный перенос, мембранный потенциал, сокращение мышц, экспрессия генов и дифференцировка клеток. Механизм Ca2+ -зависимого времени жизни сенсоров Ca2+ заключается в том, что флуорофор имеет Ca-связанную и Ca-несвязанную форму с различной квантовой эффективностью флуоресценции и, таким образом, с разным временем жизни флуоресценции. Время жизни флуоресценции связанной формы выше, чем у несвязанной формы. Следовательно, общее время жизни флуоресценции зависит от концентрации ионов Ca2+. Традиционные красители Ca 2+, такие как Calcium Green и Oregon Green Bapta, демонстрируют большие изменения времени жизни и прекрасно работают для измерения содержания Ca 2+ с помощью метода измерения времени жизни флуоресценции. Примеры показаны на рисунках ниже.
Рис. 2. FLIM изображение культивируемых нейронов, окрашенных в Oregon green OGB-1 AM. Кривые затухания времени жизни областей с низким содержанием ионов Ca (вверху) и высоким содержанием ионов Ca (внизу) показаны справа.
Рис. 3. Кончик корня ячменя, окрашенный в Oregon green. Время жизни указывает на концентрацию ионов Са
Концентрация ионов Ca2+ в клетках может изменяться в течение крайне коротких периодов времени. Реакция Ca2+ живых нейронов на стимуляцию происходит в течение нескольких миллисекунд. Тем не менее, эффекты могут быть измерены с помощью специальных методов TCSPC FLIM коррелированного по времени счета фотонов, таких как FLITS и временный мозаичный FLIM. Пример показан на рисунке ниже.
Рис. 4. Перенос ионов Ca2+ в культивируемых нейронах. Окраска Oregon Green Bapta, данные записаны с помощью временного мозаичного FLIM, 38 мс на элемент мозаики.
Визуализация хлорида
Концентрация хлорида важна для функции нейронной системы. MQAE (производное хинина) используется в качестве флуоресцентного зонда. MQAE гасится с помощью Cl-, а концентрацию можно рассчитать по изменению времени жизни через соотношение Штерна-Фольмера. На рисунке ниже показан спинальный ганглий мыши, окрашенный MQAE. Короткие времена жизни указывают на высокую концентрацию Cl- и наоборот.
Рис. 5. Спинальный ганглий мыши окрашен MQAE. Короткое время жизни указывает на высокую концентрацию хлорида Cl-
Локальная вязкость
Локальная вязкость оказывает большое влияние на скорость биохимических реакций в клетке. Было показано, что изменения вязкости на субклеточном уровне сопровождают широкий спектр клеточных нарушений. Изменения вязкости были обнаружены при гематогенных нарушениях, диабете, болезни Альцгеймера, нарушениях функции печени и раке. Вязкость в молекулярном масштабе может быть определена с помощью «молекулярных роторов». Это флуорофоры, которые имеют две более или менее жесткие части, соединенные одинарной связью. Две части могут вращаться одна против другой. Вращение - это дополнительный путь релаксации, который конкурирует с радиационной релаксацией. Поэтому способность внутреннего вращения сокращает время жизни флуоресценции. Когда вращению препятствует высокая вязкость молекулярной среды, этот путь релаксации становится менее эффективным, и время жизни флуоресценции увеличивается. Пример измерения вязкости с помощью сенсора на основе Bodipy показан на рисунке ниже.
Рис. 6. Измерение вязкости с помощью сенсора вязкости на основе Bodipy. Длинное время жизни означает высокую вязкость, и наоборот.