seqFISH — это высокочувствительный метод, который точно выявляет гены с низким числом копий, часто не выявляемые с помощью одноклеточной RNAseq или иммуноокрашивания. Кроме того, обратная транскрипция или PCR -амплификация часто искажают количественную оценку в RT-PCR и секвенировании РНК. Поскольку seqFISH можно применять к любому типу ткани без предварительного отбора генов, данный метод позволяет беспристрастно открывать новые гены, имеющие отношение к определенным биологическим явлениям.
Зачем использовать микрофлюидику для флуоресцентной гибридизации in situ?
Использование микрофлюидики является наиболее эффективным методом для выполнения MERFISH (мультиплексная устойчивая к ошибкам флуоресцентная гибридизация in situ) или seqFISH (последовательная флуоресцентная гибридизация in situ) и наблюдения за несколькими генами и их пространственной конфигурацией, потому что:
- это позволяет проводить эксперименты со значительно меньшим количеством дорогих красителей и буферных растворов;
- микрофлюидика полностью совместима с биологическими приложениями и наблюдениями под микроскопом;
- может быть реализована автоматизированная последовательность введения растворов в клетку, что создает определенную экспериментальную установку.
- Elveflow может интегрировать микрофлюидную платформу, чтобы сделать ее еще более компактной и простой в использовании.
- Вы можете использовать несколько разных чипов, подключенных к системе, чтобы легко наблюдать за разными образцами параллельно.
Этот набор можно комбинировать с другими микрофлюидными платформами и приборами перед установкой флуоресцентной гибридизации in situ. Например, для выделения одиночных клеток можно использовать микрофлюидную инкапсуляцию одиночных клеток [Mayr U., 2019]. Микрофлюидику также можно использовать для метода под названием MA-FISH, в котором используются колебательные потоки разбавленных растворов зондов или для выполнения штрих-кодирования (DBiT-seq). Elveflow уже более 10 лет является экспертной компанией по управлению микрофлюидным потоком и может предоставить свои самые современные знания в области биологии и инженерии, таким образом, являясь идеальным партнером для вас при переходе на микрофлюидику.
Схематичное описание мультиплексных методов обнаружения РНК и белков. [Mayr U., 2019]
Принцип пространственной транскриптомики
seqFISH производит точную количественную оценку уровней мРНК in situ [Shah, 2016]
SeqFISH и MERFISH используют обнаружение зонда для пространственной транскриптомики одиночных клеток [Shah, 2016; Raj A, 2008; Asp, M., 2020 ]. Сначала проводят гибридизацию in situ с одним набором флуоресцентных FISH-зондов и меченым красителем. Затем ДНКаза используется для удаления флуорофоров, и мРНК снова гибридизуется с идентичными зондами FISH, но с другим красителем для метки. Несколько раундов гибридизации и другие красители позволяют штрих-кодировать несколько генов в одной клетке [Lubeck, E, 2014].
SeqFISH+ — это усовершенствованный метод seqFISH, идеально подходящий для изучения пространственных и биологических процессов в клетках. Он сочетает в себе seqFISH с конфокальным микроскопом, генерирующим изображение сверхвысокого разрешения и мультиплексирование 10 000 генов в одной клетке [Eng, CH.L., 2019].
Надежная флуоресцентная гибридизация in situ с мультиплексной ошибкой (MERFISH) представляет собой улучшенную флуоресцентную гибридизацию одной молекулы in situ (smFISH). Метод массово распараллеливает и одновременно пространственно идентифицирует сотни тысяч видов РНК. Кроме того, этот метод обнаруживает ошибки, которые затем могут быть исправлены устойчивым к ошибкам способом благодаря использованию некоторого неназначенного двоичного штрих-кода. В этом основное отличие от seqFISH, который кодируется цветовой последовательностью [Moffitt, 2016].
Технологии «лаборатория на чипе» и микрофлюидные платформы улучшают методы seqFISH и MERFISH за счет снижения стоимости и времени эксперимента, обеспечивая автоматизацию процесса и улучшения воспроизводимости [Rodriguez-Mateos, 2020].