Исследование патогенов с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения

Примером преимущества визуализации сверхвысокого разрешения с помощью метода микроскопии dSTORM является исследование визуализации вирусных частиц, в котором поверхностный гликопротеин и факторы клеточного хозяина, включенные в реконструированные частицы ВИЧ, были исследованы с разрешением, достигающим 20 нм, что позволило изучить размеры частиц и пространственное распределение кофакторов.

Микроскопия сверхвысокого разрешения также использовалась для исследования субвирусных частиц патогенных вирусов. Одним из наиболее сложных аспектов изучения архитектуры вирусных частиц является их размер, так как в обычных световых микроскопах они выглядят как структуры ограниченные дифракцией, размеры и конструктивное расположение которых невозможно точно измерить.

На рисунках A и B показаны нуклеокапсидоподобные сборки вируса Марбург, визуализированные с помощью метода микроскопии dSTORM. Наблюдаемая ширина нити нуклеокапсида субвирусной частицы составляла приблизительно 105 нм (шкала на рисунке A). Эти данные также показали, что структурная ориентация нуклеокапсида имеет форму штопора (рисунок B), как было замечено до использования исследований с помощью криоэлектронных методов микроскопии.

Рисунок 1. Нуклеопротеин вируса Марбург, экспрессируемый в клетках гепатомы человека (HuH-7), был помечен AF647 и визуализирован с помощью метода dSTORM с использованием буфера BCubed.

Двухцветное отслеживание - это мощный инструмент для идентификации отдельных частиц с высокой точностью. Помечая две представляющие интерес молекулы спектрально различными флуорофорами, можно изучить и количественно оценить динамическое поведение каждой, используя другую в качестве сравнения или ориентира.

Для более крупных патогенов, таких как бактерии и грибы, отслеживание отдельных частиц позволяет охарактеризовать поведение отдельных молекул по отношению друг к другу, клеточным структурам или хромосомным маркерам. На рисунке представлен пример, демонстрирующий отслеживание одной частицы белка T3SS (молекулярный шприц, также известный как «инъекциома», используемый грамотрицательными бактериями для введения эффекторных белков в клетки-хозяева) в бактериях. Метод отслеживания одной частицы применяется для описания того, как комплексы T3SS активируются и регулируются во время процесса заражения, и как их функция может контролироваться или подавляться.

Белок T3SS необходим для вирулентности многих важных патогенов человека, включая Salmonella, Shigella и патогенные штаммы Escherichia coli, которые вызывают несколько миллионов смертей в год. Это также особенно важно при внутрибольничных инфекциях, например, при синегнойной палочке, когда оно связано с повышенной устойчивостью к антибиотикам и тяжелыми симптомами заболевания. Таким образом, T3SS является важной мишенью для противовирусной терапии.

Рисунок 2. Отслеживание одной частицы белка T3SS-HALO, окрашенного JF549, в живых бактериях. Образец предоставлен доктором А. Дипольдом, Институт земной микробиологии им. Макса Планка, Марбург, Германия.

Взаимодействие между вирусом и клеткой-хозяином является неотъемлемой частью жизненного цикла любого вируса, так как все вирусы зависят от своего хозяина для процесса размножения. Вот почему чрезвычайно важно понимать проникновение вируса, репликацию внутри клетки-хозяина и высвобождение из нее. Одна из проблем при изучении этих шагов заключается в том, что взаимодействие вируса с хозяином происходит ниже дифракционного предела обычных световых микроскопов.

Анализируя движение вирусных частиц с помощью метода отслеживания отдельных частиц, можно понять механизмы вирусных частиц, например, при лечении лекарствами, и наблюдать их в среде живых клеток.

Отслеживание нуклеокапсидоподобных структур вируса Эбола      (NCLS-GFP) в клетках Huh-7 печени человека.

Визуализация патогена с нанометровым разрешением

Изучение механизмов заболевания, потенциальных мишеней для вакцины и разработка точных терапевтических агентов сопряжено с множеством проблем. Одним из важнейших является сочетание дополнительных методов характеризации, таких как информация сверхвысокого разрешения, с динамической визуализацией патогенов и их взаимодействий с клетками-хозяевами.

Простая количественная характеристика патогенов

Стадии патогенеза или заражения происходят в разных временных масштабах - от нескольких секунд до часов. Поэтому очень важно иметь возможность следить за этими процессами в режиме реального времени, не нарушая исследуемую биологическую систему. С технической точки зрения для этого требуется микроскоп, который совместим с долгосрочным отображением живых клеток и отвечает требованиям чувствительности к отдельным молекулам.

HALO-меченный белок FtsK, связанный с лигандом TMR, отслеживание отдельных частиц в клетках Mycobacterium smegmatis. Образцы предоставлены лабораторией Закревска-Цервинска, Вроцлавский университет, Польша

Беспрецедентная стабильность и компактный дизайн микроскопа Nanoimager позволяют проводить микроскопию сверхвысокого разрешения и использовать различные режимы визуализации в условиях ограниченного пространства и первостепенной важности безопасности. Компания ONI разработала микроскоп Nanoimager как решение «под ключ», объединяющее передовые методы визуализации сверхвысокого разрешения в интуитивно понятную, компактную и стабильную систему. Специальное программное обеспечение компании ONI, NimOS, позволяет производить локализацию в реальном времени и последующую количественную оценку размера вирусных частиц, скорости диффузии и концентрации быстрым и удобным для пользователя способом. В сочетании с уникальной способностью минимизировать вибрации, микроскоп Nanoimager представляет собой идеальную платформу для установки в шкафу биобезопасности, где исследователи могут с легкостью проводить эксперименты с одной молекулой и сверхвысоким разрешением над инфекционными агентами.