Руководство по визуализации внеклеточных везикул с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения

12 Апреля 2021 11:56

// Микроскопия

Это руководство посвящено недавнему прогрессу в области флуоресцентной визуализации со сверхвысоким разрешением и характеристике внеклеточных везикул. Визуализация внеклеточных везикул имеет фундаментальное значение для нашего понимания их роли во всех аспектах межклеточного взаимодействия.

Введение: внеклеточные везикулы

Экзосомы и другие внеклеточные везикулы играют ключевую роль в межклеточной коммуникации. Внеклеточные везикулы могут преодолевать биологические барьеры (например, гематоэнцефалический барьер) и проникать внутрь клетки с высокой степенью специфичности. Таким образом, они являются идеальным кандидатом для новых методов доставки лекарств и диагностики заболеваний.

Часть 1

Визуализируйте внеклеточные везикулы в клетках или растворе

Значительный и растущий объем научных статей подчеркивает, что внеклеточные везикулы являются важными компонентами в путях межклеточной коммуникации. Визуализация внеклеточных везикул имеет фундаментальное значение для нашего понимания их роли во всех аспектах: от упаковки сигнальных молекул и нуклеиновых кислот во время биогенеза везикул до отслеживания их поглощения и последствий после интернализации в выбранных клетках-мишенях или тканях.

Проблемы визуализации внеклеточных везикул

Внеклеточные везикулы, происходящие из разных клеток или тканей, предназначены для определенных участков-мишеней, где они выполняют определенные функции. Поскольку внеклеточные везикулы сильно различаются как по размеру, так и по содержанию белка, считается, что наличие определенных биомаркеров (включая тетраспанины, интегрины и другие белки) в разных подгруппах внеклеточных везикул может быть основной причиной такой селективности. Однако определение этих биомаркеров на отдельных внеклеточных везикулах представляет собой серьезную проблему для исследователей в этой области.

Хотя методы электронной микроскопии позволяют увидеть отдельные внеклеточные везикулы, они не позволяют легко обнаруживать несколько маркеров одновременно и ограничиваются исследованием фиксированных клеток. С помощью традиционных методов световой микроскопии можно пометить ряд белков, но небольшой размер внеклеточных везикул означает, что большинство из них не достигают предела разрешения световой микроскопии, что ограничивает полезность этих методов для идентификации различных субпопуляций везикул.

Сверхвысокое разрешение для характеристики внеклеточных везикул

Микроскопия сверхвысокого разрешения превосходит дифракционный барьер оптического разрешения обычных световых микроскопов и позволяет обнаруживать и количественно определять отдельные белки и нуклеиновые кислоты на субвезикулярном уровне. Кроме того, структурный состав мембран везикул можно реконструировать с помощью микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM), достигая разрешения 20 нм, и можно использовать для идентификации конкретных биомолекул, участвующих в передаче сигналов и таргетирования внеклеточных везикул.

Применение методов визуализации сверхвысокого разрешения имеет большое значение для выявления и визуализации субпопуляций внеклеточных везикул и может дополнительно предоставить важную информацию о роли внеклеточных везикул в прогрессировании заболевания.

Отслеживание движений внеклеточных везикул в живых клетках

Когда внеклеточные везикулы достигают своих клеток-мишеней, они связываются с плазматической мембраной, где они либо интернализируются, либо высвобождают свое содержимое в цитоплазму посредством слияния мембран - процесс, который плохо изучен.

Усовершенствованная флуоресцентная микроскопия позволяет обнаруживать отдельные внеклеточные везикулы в режиме реального времени, отслеживать их взаимодействие и поглощение живыми клетками, а также визуализировать их движения после интернализации.

На видео справа представлена покадровая видеосъемка эндотелиальных клеток пупочной вены человека с ядром, помеченным Hoechst (зеленый), и внеклеточных везикул, помеченными AF647 (пурпурный). Образцы предоставлены Марией Панагопулу и доктором Маргарет Патерсон из лаборатории профессора Кристофера Грегори, Эдинбургский университет.

Часть 2

Размер и подсчет с отслеживанием частиц

В дополнение к визуализации динамики внеклеточных везикул в живых клетках, флуоресцентная микроскопия одиночных молекул может использоваться для отслеживания траекторий флуоресцентно меченных везикул в растворе с помощью метода, широко известного как анализ отслеживания наночастиц (NTA – nanoparticle tracking analysis) - отслеживающий анализ броуновского движения отдельных частиц. Метод NTA вычисляет скорость движения частиц, известную как коэффициент диффузии, и отсюда оценивает размер наночастиц. Поскольку NTA-анализ обнаруживает отдельные частицы, он также полезен для измерения концентрации частиц в растворе. Эти особенности метода NTA предоставляют количественную информацию о свойствах внеклеточных везикул в растворе, а именно о размере и концентрации, что объясняет широкое применение NTA анализа в сообществе исследователей внеклеточных везикул.

Преимущества флуоресценции одиночных молекул для определения характеристик по методу NTA

Обнаружение единичных внеклеточных везикул для анализа NTA может быть достигнуто либо по светорассеянию, либо по сигналу флуоресценции, исходящему от одной частицы. Флуоресцентная визуализация может обеспечить значительные преимущества по сравнению с NTA-анализом на основе рассеяния света. Например, рассеяние света приводит к неспецифическому обнаружению частиц, в то время как флуоресцентная визуализация на основе антител или окрашивания мембран обеспечивает высокоспецифичное обнаружение, поэтому количественно оцениваются только частицы, которые их интересуют.

Кроме того, одна внеклеточная везикула может быть окрашена двумя биомаркерами, каждый из которых имеет различную сигнатуру флуоресценции. Визуализация флуоресценции меченых внеклеточных везикул в двух флуоресцентных каналах одновременно и объединение этого с двухцветным NTA анализом добавляет еще один уровень ценной информации:

- Характеристика внеклеточных везикул и их субпопуляций: используя один общий маркер внеклеточных везикул (например, мембранный краситель) в одном цвете и определенный маркер для внеклеточных везикул (например, CD9) в другом, можно изучить долю внеклеточных везикул с конкретным маркером в одном эксперименте.

- Высокоспецифичная маркировка популяций внеклеточных

везикул: внеклеточные везикулы содержат несколько маркеров, и изучение популяций внеклеточных везикул с помощью высокоспецифичных маркеров (таких как CD9 или специфические молекулы РНК) с использованием двухцветной визуализации может быть очень полезным способом уверенно идентифицировать интересующие вас внеклеточные везикулы. Это позволяет следить только за внеклеточными везикулами с двойной маркировкой и исключать нежелательную популяцию во время анализа.

- Распределение размеров конкретных популяций: двухцветный NTA анализ позволяет обнаруживать конкретную популяцию внеклеточных везикул и измерять ее распределение по размерам в более широкой популяции.

На рисунке выше справа представлен пример отслеживания с использованием меченых внеклеточных везикул в растворе. Очищенные внеклеточные везикулы были помечены PHK67 (мембранное окрашивание) и визуализированы при температуре 37 °C. Внеклеточные везикулы отображают диапазон коэффициента диффузии, как показано с помощью цветных дорожек, появляющихся в реальном времени и отображаемых на гистограмме. На вставке показаны примеры кадров широкопольных кадров с внеклеточными везикулами (голубой цвет). Полученная информация была использована для определения распределения размеров внеклеточных везикул, которое оказалось относительно широким диапазоном с максимумом около 100 нм. Этот анализ может выявить относительную численность различных подтипов популяций на основе их распространения и размера.

Часть 3

Понять размер, количество, визуализировать

Один из самых сложных аспектов изучения внеклеточных везикул и, возможно, один из самых важных - это сочетание нескольких дополнительных методов определения характеристик. Набор инструментов, доступных для определения размера и количества внеклеточных везикул, кажется, редко согласуется, и увидеть внеклеточные везикулы на уровне единственной везикулы остается трудной задачей. Что, если бы один микроскоп мог обеспечить независимые измерения размеров и позволить Вам напрямую сравнивать размер и количество внеклеточных везикул с данными in vivo с разрешением одной везикулы?

Измеряйте и отслеживайте

Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул предлагает наиболее чувствительные доступные флуоресцентные измерения. При правильной настройке этот метод можно использовать для отслеживания траекторий флуоресцентно меченных везикул в растворе. Основываясь на траекториях и соответствующих измерениях диффузии, пользователь может быстро оценить распределение размеров и концентрацию популяции внеклеточных везикул, как описано в предыдущей главе. Важно отметить, что использование одномолекулярного флуоресцентного микроскопа позволяет нам извлекать эту информацию с большей чувствительностью, чем с любым другим отслеживающим флуоресцентным прибором.

Особым преимуществом использования одномолекулярного микроскопа сверхвысокого разрешения является то, что

Изображение dSTORM внеклеточных везикул, выделенных из культуральной среды кератиноцитов человека, иммуномеченных CD63 (синий) и CD81 (желтый), и поверхности мембраны везикул (WGA, пурпурный).

он обеспечивает измерения размера и концентрации на основе отслеживания, а также предлагает исключительное разрешение для визуализации одной и той же популяции внеклеточных везикул в клетках. После классификации везикул с помощью данных отслеживания. Вы можете добавить их к клеткам и исследовать их биологическую функцию, визуализируя их взаимодействие с помощью различных режимов визуализации.

Визуализация может включать живые клетки: изучение поглощения с помощью покадровой визуализации с высоким разрешением или отслеживание в реальном времени для изучения взаимодействия внеклеточных везикул с мембраной клетки-мишени. В качестве альтернативы, это может включать фиксацию клеток по прошествии достаточного времени для захвата внеклеточных везикул и использование микроскопии методом dSTORM с разрешением 20 нм для изучения взаимодействия внеклеточных везикул с молекулами в клетках-мишенях (например, лизосомами, эндоцитарными маркерами) с беспрецедентным разрешением.

Характеристика внеклеточных везикул

Надежный способ охарактеризовать внеклеточные везикулы - применить два полностью противоположных метода в одном и том же приборе. Микроскопия dSTORM - это метод визуализации флуоресцентно меченных молекул с разрешением 20 нм. Это означает, что метод dSTORM может сообщать о маркерах, присутствующих в отдельных везикулах (например, о содержании белка или РНК), а также об их распределении на везикулах относительно друг друга. Важно отметить, что это также означает, что микроскопия dSTORM может использоваться для непосредственного определения размера везикул на поверхности стекла путем их визуализации таким же образом, как электронная микроскопия использовалась в прошлом.

В одномолекулярном микроскопе сверхвысокого разрешения размер, полученный с помощью визуализации сверхвысокого разрешения, затем можно напрямую сравнить с измерениями размера на основе метода отслеживания молекул, взятыми из той же популяции везикул, диффундирующих в растворе, как объяснено выше.

Микроскоп Nanoimager для визуализации внеклеточных везикул

Микроскоп Nanoimager - один из самых чувствительных доступных микроскопов, благодаря его уникальной закрытой конструкции. Он идеально подходит для исследователей в области внеклеточных везикул, поскольку Nanoimager поставляется с индивидуальным анализом для определения размера и измерения концентрации внеклеточных везикул, поддерживает микроскопию сверхвысокого разрешения, а также визуализацию живых клеток в самом доступном формате из когда-либо созданных. Используя этот прибор, популяции внеклеточных везикул могут быть охарактеризованы противоположными методами и впоследствии визуализированы для измерения их взаимодействия и поглощения клетками. В одном образце можно измерить до четырех молекулярных видов с использованием разных флуоресцентных маркеров.