Использование dSTORM микроскопии для изучения очищенных внеклеточных везикул

Клетки выделяют различные типы мембранных везикул малого размера (от 30 нм до 1000 нм) как способ общения с другими клетками и удаления нежелательного содержимого клеток. Эти везикулы все вместе известны как внеклеточные везикулы (EV - extracellular vesicles). В этой статье мы расскажем о том, как была оптимизирована визуализацию очищенных внеклеточных везикул для изучения их размера, содержания и поведения с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения.

Что мы можем определить как внеклеточные везикулы?

Внеклеточные везикулы были классифицированы в соответствии с их размером и происхождением, как, среди прочего, экзосомы или микровезикулы. Тем не менее, после недавней ежегодной конференции Международного общества внеклеточных везикул (ISEV) в Киото, Япония общество опубликовало заявление, одобряющее «использование общего термина внеклеточная везикула (EV) для частиц, естественно высвобождаемых из клетки, которые отграничиваются липидным бислоем» и которые не могут реплицироваться (не содержат функционального ядра)». Важно отметить, что они подчеркнули, то что, если конкретные маркеры не могут быть использованы для надежного установления субклеточного происхождения различных внеклеточных везикул, или они не отображаются в реальном времени во время высвобождения из клетки, ученые должны продолжить ясно использовать термины, такие как экзосомы или микровезикулы, поскольку они могут представлять противоречивые определения и неточные ассоциации биогенеза. Согласно их рекомендациям, подтипы внеклеточных везикул должны быть описаны по следующим критериям:

- Физические характеристики внеклеточных везикул, такие как размер: маленькие внеклеточные везикулы (sEV) <200 нм или средние/большие внеклеточные везикулы (м/lEV);

- Биохимический состав: тетраспанины CD63+ / CD81+ - внеклеточные везикулы, окрашенные аннексином A5 внеклеточные везикулы и другие;

- Описания условий или клетки происхождения: внеклеточные везикулы подоцитов, гипоксические внеклеточные везикулы, крупные онкосомы, апоптотические тела, мультивезикулярные тела.

Узнайте больше о номенклатуре внеклеточных везикул в заявлении, опубликованном ISEV здесь.

Почему ученые исследуют внеклеточные везикулы?

Внеклеточные везикулы (EV) могут быть обнаружены в сыворотке, внеклеточных средах и во всех биологических жидкостях, включая спинномозговую жидкость, слизь, молоко или мочу. Сравнение между клетками, выращенными в обычной среде или с так называемой «обедненной экзосомами» сывороткой, показало способность внеклеточных везикул вмешиваться в биологические функции (например, в пролиферацию клеток) (Корнилов и др. 2018). Это привело к более исчерпывающему исследованию функции внеклеточных везикул с быстро растущей областью.

Внеклеточные везикулы - это высокостабильные частицы, заключенные в мембраны, которые могут транспортировать различные молекулы, такие как РНК, ДНК или белки; эти молекулы могут быть либо связаны с мембраной, либо заключены внутри везикул. Внеклеточные везикулы также могут иметь различные характеристики в зависимости от типа клеток, которые их высвобождают, что может оказать существенное влияние на их состав. Циркулирующие внеклеточные везикулы теперь, по сути, понимаются как маленькие сигнальные единицы, путешествующие по нашему телу на большие расстояния. Следовательно, ученые заинтересованы в том, чтобы лучше охарактеризовать внеклеточные везикулы и исследовать их сигнальные функции при ряде заболеваний, таких как рак (метастазирование) или нейронауки, а также в критических иммунных реакциях на физиологические и патологические процессы.

Кроме того, ученые изучают использование искусственно созданных внеклеточных везикул для транспортировки и доставки определенных фрагментов РНК или ДНК в определенные ткани или типы клеток. Это может помочь заставить определенные лекарства преодолевать гематоэнцефалический барьер при нейронных расстройствах и потенциально существенно повлиять на биодоступность и эффективность лечения.

Каковы текущие проблемы и ограничения при изучении и визуализации внеклеточных везикул?

Одной из основных проблем работы с внеклеточными везикулами является их очистка без ущерба для их морфологии и состава. Несколько экспертов в этой области поделились своими знаниями о лучших процедурах для этого этапа исследований, и, хотя работа по его улучшению еще не завершена, исследователи сосредоточены на методах выделения внеклеточных везикул на основе ультрацентрифугирования и исключения по размеру.

До недавнего времени некоторые из основных инструментов, доступных для характеристики внеклеточных везикул после очистки и получения важной информации об их размере, составе и подгруппах населения, были кратко описаны ниже. Эти методы имеют различные ограничения и изучают внеклеточные везикулы с высоким разрешением, в то время как получение соответствующей функциональной и структурной информации остается проблемой.

- Протеомный анализ: используется для характеристики состава внеклеточных везикул путем анализа определенных или новых белковых маркеров разных популяций внеклеточных везикул. К ним относятся Вестерн-блоттинг и масс-спектрометрия. Основные ограничения - требуются высокие концентрации исходного материала и антител, сильно подверженные неспецифическому связыванию антител. Невозможно получить динамические данные, размеры или морфологическую информацию.

- Электронная микроскопия: была стандартной техникой визуализации, используемой для визуализации наноразмерных деталей внеклеточных везикул до недавних достижений в световой микроскопии. Основные ограничения - пробоподготовка в электронной микроскопии может быть довольно жесткой для внеклеточных везикул, так как это может повлиять на их морфологию (имеются сообщения об овальных, круглых и даже чашеобразных внеклеточных везикулах), что отразится на согласованности полученных результатов. Кроме того, электронная микроскопия опирается на специальные знания и реагенты и представляет собой многоэтапную процедуру, которая может занимать много времени и, следовательно, может оказаться сложной при выполнении множественной визуализации.

- Получение изображений и нано-проточная цитометрия: анализ частиц, проходящих через оптическое поле, на основе потока был использован для изучения популяций внеклеточных везикул. Основные ограничения - низкое пространственное разрешение, так как большинство проточных цитометров не предназначены для обнаружения везикул в нижней части диапазона размеров внеклеточных везикул (за некоторыми исключениями). Кроме того, эти методы в значительной степени основаны на специфичности антител без возможности оценки пространственного распределения флуоресцентного сигнала, что потенциально может привести к неправильной интерпретации данных из-за ложных срабатываний или неспецифического связывания внеклеточных везикул с гранулами.

В последние годы были предприняты дополнительные усилия для разработки методов захвата внеклеточных везикул в растворе с использованием методов иммунозахвата на пластинках, которые основаны на антителах для связывания белков внеклеточных везикул. Однако внешний состав поверхностного слоя внеклеточных везикул может затруднить оценку специфичности и получение согласованных данных.

Подход Oxford Nanoimaging к визуализации очищенных внеклеточных везикул

На сегодняшний день флуоресцентная визуализация сверхвысокого разрешения внеклеточных везикул не была доступным методом для ученых в этой области. Это важно не только для того, чтобы иметь возможность визуализировать отдельные молекулы, но также иметь возможность анализировать различные популяции внеклеточных везикул, что невозможно сделать с помощью обычных методов микроскопии. Микроскопия сверхвысокого разрешения теперь позволяет ученым определять локализацию различных маркеров внеклеточных везикул как присутствующих на поверхности или внутри везикулы в качестве носителя.

Изображение: Внеклеточные трехцветные везикулы, выделенные из культуральной среды кератиноцитов, меченной окраской лектина (мембрана внеклеточных везикул красного цвета) и флуоресцентно конъюгированные антитела против тетраспанинов (CD63 зеленого цвета и CD81 в пурпурном), визуализировали с помощью микроскопа Nanoimager с использованием dSTORM микроскопии. Масштабная линейка составляет 100 нм.

В лаборатории компании Oxford Nanoimaging команда по визуализации хотела сначала найти способ маркировки мембраны внеклеточных везикул. Были опробованы несколько красителей, чтобы выбрать те, которые подходят для dSTORM микроскопии (липофильные имеют тенденцию осаждаться и генерировать артефакты и/или химически не подходят для dSTORM). Было решено сузить его до поверхностного гликопротеинсвязывающего лектина, связанного с Alexa Fluor 647, чтобы пометить группы сахаров на поверхности внеклеточных везикул (как показано на схеме сверху, зеленая метка). Другой подходящей мембранной меткой, является класс липофильных красителей, коммерчески известных как красители CellMask™, которые накапливаются на мембранном бислое и имеют химические структуры, подходящие для получения изображений с высоким разрешением (верхняя схема, желтая метка).

Даже после тщательных шагов по оптимизации протокола иммунофлуоресцентного окрашивания, одной из оставшихся проблем было уменьшение неспецифического окрашивания фона, связанного с покровным стеклом. Для этого был использован внутренний протокол для маркировки внеклеточных везикул. Затем нанесли внеклеточные везикулы на покрытые оболочкой BSA покровные стекла, что минимизирует связывание свободных меток. Наконец, внеклеточные везикулы были оставлены для оседания и прикрепления к покровному стеклу, что обеспечивает стабильность, необходимую для высокоточной локализации молекул. После осторожной промывки и добавления соответствующих буферов dSTORM изображения внеклеточных везикул были отображены в сверхвысоком разрешении с помощью микроскопа Nanoimager.

Микроскоп Nanoimager предлагает возможность комбинировать различные методы на основе световой микроскопии для изучения внеклеточных везикул, включая визуализацию dSTORM с разрешением около 20 нм. Можно получить общий обзор выборки, содержащей множество внеклеточных везикул, данные колокализации, подсчет, определение размера и отслеживание внеклеточных везикул - это компактное решение для исчерпывающего экономически эффективного изучения внеклеточных везикул! Хотя dSTORM микроскопия позволяет визуализировать детали на наноразмерном уровне, важные многопараметрические данные о населенности могут быть получены из свободной диффузии внеклеточных везикул с двумя флуоресцентными метками. Это позволит классифицировать везикулы по размеру и наличию или отсутствию маркеров.

Сделанные выводы

В нашем случае внеклеточные везикулы были первоначально очищены из среды для культивирования клеток с использованием коммерчески доступных наборов (например, на основе преципитации) для очистки внеклеточных везикул. Как уже упоминалось, очистка представляет собой сложный этап, который необходимо оптимизировать, чтобы гарантировать, что форма и состав везикул остаются максимально приближенными к физиологическим.

Недавно был оптимизирован протокол для 3-цветной визуализации, чтобы визуализировать широкую популяцию внеклеточных везикул и количественно определить субпопуляции, используя два отдельных маркера. Как было выяснено, популяции внеклеточных везикул могут проявлять неоднородность на нескольких уровнях, что затрудняет реализацию общей стратегии маркировки. Исходя из наблюдений Oxford Nanoimaging, рекомендуется соблюдать осторожность при выборе стратегии маркировки, особенно при сравнении внеклеточных везикул различного происхождения. Вот несколько общих советов, которые следует учитывать при планировании экспериментов на внеклеточных везикулах:

Совет № 1: при использовании антител остерегайтесь специфичности антител. Некоторые компоненты на поверхности вокруг внеклеточных везикул склонны связывать белки неспецифическим образом.

Совет № 2: Делайте время визуализации как можно короче (визуализация происходит довольно скоро после изоляции). Помните, что внеклеточные везикулы не являются фиксированными, что делает их менее стабильными, но более неповрежденными и менее подверженными артефактам.

Что касается биологии внеклеточных везикул, существует много проблем и неизвестных механизмов, таких как те, которые связаны с проникновением в клетку (слияние мембран или эндоцитоз) и динамическими взаимодействиями в живой клетке, особенно при рассмотрении различных типов клеток. Будущие исследования по профилированию внеклеточных везикул с использованием масс-спектрометрии или секвенирования также помогут расширить область, которая открывается некоторыми действительно захватывающими открытиями!