Как настроить ваш микроскоп для получения ярких высококонтрастных флуоресцентных изображений

Тип источника и количество света, попадающего на плоскость образца, могут как помочь при выполнении экспериментов флуоресцентной микроскопии, так и навредить.  Рассмотрим, как можно настроить интенсивность излучения, чтобы обеспечить качественные изображения и данные.

Введение

Многие факторы влияют на качество изображения, и в флуоресцентной микроскопии свет, попадающий на плоскость образца, играет важную роль и может стать как ключом к экспериментальным прорывам, так и причиной неубедительных результатов.

Существует множество способов измерить количество света в плоскости образца-известное как интенсивность излучения. Например, с помощью предметных стекол Argo-POWER. Использование стандартизированного метода позволяет пользователям микроскопов количественно определять и сравнивать интенсивность света в плоскости образца и, следовательно, непосредственно сравнивать системы, чтобы найти идеальное решение для них.

Теперь рассмотрим, как повысить освещенность полезным светом до оптимальных уровней, необходимых для экспериментальной установки. Когда мы говорим о "полезном свете", мы имеем в виду не только количество света, но также длину волны и продолжительность экспозиции. Гарантируя, что эти свойства являются оптимальными, можно значительно улучить качество эксперимента.

Выбор правильной системы освещения

Если вы хотите улучшить освещение образца, то необходимо обратить внимание на систему освещения, используемую в вашем микроскопе. В настоящее время промышленность переживает переход к более новой технологии.

С тех пор как в 2006 году на рынке появилась первая светодиодная осветительная система для флуоресцентной микроскопии, лаборатории все чаще переходят к этому современному источнику света благодаря его многочисленным преимуществам. Как интенсивность излучения современных светодиодных осветительных систем сравнима с обычными ртутными и металло-галидными лампами? Исторически интенсивность излучения светодиодов считалась низкой, но технология развивалась, и сегодня светодиоды эквивалентны или ярче во многих областях спектра (Рис.1). В нижней части спектра светодиодное излучение превзошло излучение металло-галидных ламп, однако в зеленой области светодиодное излучение все еще имеет окно для развития. Этот "зеленый зазор" хорошо известен в индустрии светодиодных технологий и является результатом отсутствия подходящих полупроводниковых материалов. Хорошая новость заключается в том, что эффективность светодиодов повышается в соответствии с законом Хайца, который гласит, что излучение света, генерируемого светодиодом, увеличивается в 20 раз за каждое десятилетие. Более того, как будет показано далее, это не недостаток светодиодов, как может показаться на первый взгляд, и в случае визуализации живых клеток это даже преимущество.

Рис.1 Спектр излучения металло-галидной лампы в сравнении со спектром светодиодного освещения (pE-300ultra)

Почему лаборатории переходят на светодиодное освещение?

Производительность: интенсивность излучения снижается в течение всего срока службы ртутной или металло-галидной лампы, в то время как светодиоды со временем становятся гораздо более стабильными.

Удобство: лампы часто нуждаются в замене, в то время как светодиоды долговечны. Юстировка, необходимая после частой замены ламп, является сложной, тогда как светодиоды могут быть выравнены на заводе и готовы к установке в микроскоп.

Стоимость: помимо экономии на компонентах, более длительный срок службы светодиодов в долгосрочной перспективе обходится дешевле. Также они позволяют избегать специальных расходов на утилизацию, которые необходимы при работе с лампами высокого давления и ртутными лампами.

Безопасность и окружающая среда: ртуть в лампах опасна для людей и окружающей среды. Лампы также оставляют включенными в течение нескольких дней во время экспериментов, в то время как светодиоды могут быть легко выключены, когда они не используются, что снижает потребление энергии. Кроме того, светодиоды более энергоэффективны и выделяют гораздо меньше тепла.

Светодиодная технология и привод для увеличения интенсивности излучения

Современные системы светодиодного освещения для естественных наук идеально подходят для подавляющего большинства применений флуоресцентной микроскопии широкого поля. При выборе системы освещения для применений, требующих более высокой освещенности, доступны системы, которые монтируются непосредственно к задней части микроскопа вместо использования жидкостного световода, тем самым уменьшая потери (Рис.2). Они не только избегают потери интенсивности излучения, поскольку жидкостный световод со временем деградирует, но и являются более экономичными, т.к. не требуют замены световода. Если необходимо использовать жидкостный световод, то интенсивность освещения можно увеличить, переключившись на 1.5 м вместо 3 м моделей и оптимизировав настройки коллиматора по методу Келера.

Поскольку растущая эффективность светодиодов приводит к увеличению интенсивности излучения, светодиоды теперь обычно демонстрируют эффективность выше 30%, в то время как традиционные лампы в основном ниже 10%. По мере повышения эффективности это также снижает тепловыделение, что имеет дополнительное преимущество, поскольку снижение рабочей температуры, как известно, увеличивает срок службы светодиода. Повышение интенсивности излучения и продление срока службы с помощью терморегулирования является таким важным фактором при проектировании светодиодных осветительных систем, что работа CoolLED фокусируется на ряде инноваций в этой области – например, снижение температуры светодиодов с помощью уникальных конструкций радиаторов, которые гораздо эффективнее отводят тепло от светодиода.

Рис. 2. Системы освещения, которые крепятся непосредственно на микроскоп обеспечивают большую освещенность по сравнению с моделями, использующими жидкостные световоды. 

Выбор лучших фильтров для вашего исследования

Наряду с выбором современной системы освещения и переключением на модели источников без световодов, интенсивность излучения может быть увеличена за счет оптимизации других аспектов конфигурации микроскопа, таких как оптические фильтры.

Выбор лучших оптических фильтров улучшает параметры излучения полезного света. Функция оптических фильтров состоит в том, чтобы блокировать нежелательный свет, позволяя проходить излучению на благоприятных длинах волн (т. е. оптимальных длинах волн для возбуждения выбранного флуорофора). Фильтры, оптимизированные для определенного набора флуорофоров, будут подвергать образец воздействию только наиболее подходящих длин волн, блокируя фоновый шум и приводя к более ярким и высококонтрастным изображениям. Исторически сложилось так, что фильтры были разработаны для ртутных и металло-галлидных ламп, и мы часто сталкиваемся с тем, что они используются с новыми системами светодиодного освещения. Это может поставить под угрозу качество изображения и интерпретацию данных. Теперь доступны однополосные фильтры, соответствующие спектрам светодиодов и популярных флуорофоров. При использовании с системами светодиодного освещения они увеличивают отношение сигнал/шум для одноцветного изображения и минимизируют просачивание для улучшения многоцветного изображения. Пример этого можно увидеть на рисунке 3.

Рис. 3. Выбор правильных оптических фильтров повышает яркость и контрастность изображения

Чтобы определить как фильтры влияют на интенсивность излучения для индивидуальной установки, можно рассчитать и сравнить интенсивность излучения на плоскости образца с различными фильтрами.

Более эффективное использование света

В дополнение к системе освещения и оптическим фильтрам также существуют и другие компоненты микроскопа и средства для воздействия на яркость изображений. Например, более качественные объективы позволяют большему количеству света проходить к образцу и от него (Рис. 4), в то время как более чувствительная камера будет генерировать более яркие изображения образцов, испускающих более низкие уровни сигнала. Более эффективное использование света таким образом и снижение интенсивности возбуждения уменьшает фотообесцвечивание и фототоксичность и идеально подходит для визуализации живых клеток.

Рис. 4. Компоненты микроскопа, такие как объективы, также влияют на качество изображения. Улучшенная контрастность (справа) позволяет визуализировать субклеточные структуры с большей четкостью (клетка изображена с помощью DAPI, FITC и TRITC; изображение любезно предоставлено Томом Скелхоном и Адамом Уэстмакотом, Olympus).

Визуализация живых клеток

Действительно ли необходимы более высокие значения интенсивности? В то время как промышленность стремится к более высокой интенсивности излучения, в некоторых случаях более низкая интенсивность излучения может иметь жизненно важное значение. Например, определенные флуорофоры и условия эксперимента могут привести к фотообесцвечиванию, разрушающему сигнал флуоресценции. Флуоресцентная микроскопия включает в себя воздействие на живые клетки светом, интенсивность которого во много раз выше, чем в природе, и снижение интенсивности облучения позволит избежать артефактов и неточностей данных, возникающих в результате фототоксичности. Для борьбы с этими проблемами рекомендуется использовать светодиодные системы освещения, поскольку они генерируют излучение на определенной длине волны. Это позволяет согласовать длину волны возбуждения с набором фильтров и флуорофором, тем самым уменьшая воздействие на образец нежелательного света. Мощность светодиода также может быть точно настроена между 0-100% с шагом 1% и поэтому может быть модулирована в соответствии с требованиями конкретного эксперимента. Кроме того, при источник света срабатывает только на период, необходимый для экспозиции камеры, и ни на микросекунду дольше, что особенно полезно в экспериментах с замедлением времени.

Итоги

Часто у экспериментаторов возникают вопросы об интенсивности светодиодных систем освещения, и хотя технология действительно продолжает совершенствоваться, ответ не так прост, и важно понять общую картину. Во-первых, если необходимо улучшить яркость и контрастность изображения, то нужно обратить внимание не только на систему освещения, но и учитывать разные компоненты микроскопа. В частности, оптические фильтры диктуют, насколько полезный свет возбуждает используемые флуорофоры. Во-вторых, визуализация живых клеток фактически выигрывает от улучшенного контроля интенсивности излучения, а не от общего увеличения этого параметра, и в этих случаях современные системы светодиодного освещения могут повысить качество изображения другими способами. Интересно, что уровень освещенности также связан с однородностью освещения по всему полю зрения.

Каждое приложение имеет уникальные требования, поэтому для получения более ярких изображений с лучшей контрастностью необходимо учитывать множество факторов. Если у вас возникли вопросы по подбору оборудования для получения изображений лучшего качества, обращайтесь к менеджерам компании АФ Микроскопия.