Точное измерение скорости кровотока в 3D в живой ткани, возможно, вместе с другими визуализируемыми параметрами (например, клеточной активностью) может быть очень важным в различных биологических дисциплинах и приложениях. Двухфотонная микроскопия, особенно реальная трехмерная акустооптическая двухфотонная микроскопия, обеспечивает гибкий и точный инструмент для этого и может использоваться в области неврологии, иммунологии, дерматологии, онкологии и т.
Оснащение микроскопа
- Две пары акустооптических кристаллов для быстрой фокусировки по осям XY и Z (3D-визуализация);
- Модуль 4D Beam Conditioning Unit для стабилизации лазерных лучей;
- Два двухфотонных лазерных источника с разной длиной волны;
- Дихросистема для быстрого переключения между двумя лазерами в случае квазиодновременного двойного возбуждения.
Техническая процедура сбора и анализа данных
На фотографиях ниже был введен внутривенно красный декстран, из-за которого кровеносные сосуды окрашиваются в красный цвет. Проходящие эритроциты показаны как тени в красном потоке (рис. 1А). Измерять скорость кровотока можно относительно расстояния, пройденного эритроцитом, в зависимости от времени (рис. 1B).
Рисунок 1. Как измерить скорость кровотока с помощью трехмерной акустооптической двухфотонной визуализации. A. Пример изображения и визуализации кровотока с одной 3D-полосы на глубине ~200 мкм. B. Смонтированное изображение, показывающее поток отдельных эритроцитов (желтый круг и стрелки). Средняя скорость в определенном участке капилляров или сосудов измеряется по значениям скоростей эритроцитов (v1, v2...vn).
Быстрая визуализация ROI с помощью акусто-оптической системы FEMTO3D Atlas позволяет проводить 3D сканирование полос по сосудам через большее количество слоев коры. Общая длина полос может достигать ~5 мм при сохранении разрешения и скорости, достаточных для измерения скорости кровотока (рис. 2).
Рисунок 2. Поддерживая правильную скорость сканирования для трехмерного измерения кровотока, FEMTO3D Atlas может получать сети полос длиной до 5 мм. Трехмерная реконструкция полос для измерения кровотока в коре головного мозга мыши. B. Визуализация кровотока в виде трехмерной ленточной сети длиной 4.78 мм; скорость сканирования: 7 Гц.
Одновременная визуализация различных структур
Исследования сердечных заболеваний могут быть подкреплены комбинированным методом одновременной визуализации активности Са2+ и кровотока. Это новая возможность получить локальную информацию о состоянии нейронов и сердца. Используя систему FEMTO3D Atlas Dichro с двумя лазерными источниками на двух разных длинах волн, можно одновременно измерить движение клеток крови и активность нейронов Ca2+. Используя два разных лазера, быстрое переключение между двумя разными лазерными источниками позволяет получить квазиодновременное изображение на двух разных длинах волн излучения. Это может предоставить прекрасную возможность для изучения пагубных последствий инсульта в отношении состояния сосудов, повреждения нейронов и даже процессов регенерации (рис. 3).
Рисунок 3. In vivo визуализация кровотока в глазу рыбок данио. Красный цвет указывает на клетки крови, меченные tdTomato, зеленый цвет обозначает нейроны, меченные GCaMP6.
Выводы
В данной статье дается простое описание того, как получить и проанализировать скорость кровотока в 3D с помощью большего количества слоев живой коры головного мозга. Система FEMTO3D Atlas Dichro, оснащенная самой современной технологией акустооптической микроскопии Femtonics, обеспечивает быстрое трехмерное сканирование ROI в большем объеме, а также квазиодновременное определение активности Ca2+ и кровотока с использованием двух разных лазерные источники. ПО на базе C++ и MATLAB предоставляет встроенные возможности анализа ROI и кривых, отвечающие всем требованиям. Многофотонные устройства мирового класса Femtonics могут удовлетворить все ваши экспериментальные потребности.