Арт. Celloger Pro
Введение
Клеточно-проникающие пептиды (CPP) могут быть конъюгированы с макромолекулами, такими как олигонуклеотиды, для пересечения клеточной мембраны и доставки макромолекул. Например, CPP, присоединенный к олигонуклеотидному препарату, приводил к повышению концентрации в мышцах, увеличению пропускания экзонов. Однако механизм проникновения в клетку до сих пор не раскрыт из-за его сложной природы и других сложных факторов, которые затушевывают это явление. В данном эксперименте исследователи попытались получить изображения клеток Hela с флуорофором 5-TAMRlus в режиме реального времени, с помощью микроскопа Celloger Mini Plus, который может автоматически записывать изображения в режиме таймлапс с высоким пространственно-временным разрешением.
Методы
1. Конъюгация флуорофора и пептида
- Соедините пептидную смолу GSGR7 с флуорофором 5-TAMRA (1 час).
- Очистите смолу с помощью 94% TFA, 2,5% H2O, 2,5% тиоанизола, 1% TIPS в течение 3 часов, накрыв алюминиевой фольгой.
- Очистите конъюгированный с флуорофором пептид с помощью ВЭЖХ.
2. Нанесение покрытия и визуализация клеток
День 1: Размножение клеток Hela
- Поместите 100K клеток/лунку в 12-луночный планшет, инкубируйте в течение 24 часов.
День 2: Обработка клеток пептидом GSGR7, конъюгированным с 5-TAMRA
- Оставьте 2 набора лунок только для клеток, обработанных средой или средой с лекарственным средством (ДМСО).
- Один набор лунок является отрицательным контролем
- Другие наборы лунок - 5, 10, 20
- Инкубируйте планшет в течение 1 часа.
- Промыть 1X PBS 3 раза.
- Начать визуализацию.
- Прибор: Celloger Mini Plus, визуализация в светлом поле и визуализация красной флуоресценции, 10X
- Мощность лампы: 60%, усиление: 3
- Интервальное время: 5 минут, общее время работы 3 часа
Результаты
Как показано на рис. 1, широкопольная визуализация хорошо работала в режиме автофокусировки, но автофокусировка канала флуоресценции была непростой, и наблюдалось расхождение в фокусе при сканировании каждой лунки. Далее исследователи варьировали концентрацию пептида GSGR7, конъюгированного с TAMRA, чтобы выяснить разницу в тенденции проникновения в клетки. Как и ожидалось, уровень флуоресценции увеличивается с увеличением количества конъюгированного с TAMRA пептида GSGR7 (рис. 2). Наконец, исследователи использовали функцию Image Tile для объединения изображений в широкой области, как показано на рисунке 3. Фокусировка в разных местах прошла успешно благодаря функции автофокусировки прибора.
|
|
|
Рисунок 1. Fusion (слева), канал флуоресценции (справа)
|
|
|
|
