Арт. Celloger Mini Plus
Анализ цитотоксичности, вызванной нокодазолом
Цитотоксичность - это степень повреждения клеток химическими веществами или физическими факторами. Ее измерение с помощью анализа цитотоксичности необходимо для разработки лекарств и биологических исследований. Большинство анализов цитотоксичности измеряются в конечной точке, что затрудняет изучение динамического ответа клеток на лекарственные препараты.
Цель приведенного исследования - изучить эффективность анализа цитотоксичности с помощью визуализации в реальном времени. Клетки, обработанные различными концентрациями нокодазола, противоракового препарата, окрашивались флуоресцентным красителем во время гибели клеток, а затем отслеживались с помощью визуализации микроскопом Celloger® Mini Plus. С помощью временной визуализации было замечено, что апоптоз увеличивается в зависимости от дозы нокодазола, а степень апоптоза была количественно измерена и отображена на графике с помощью программного обеспечения Analysis, поставляемого с микроскопом Celloger® Mini Plus.
Клетки HeLa высевали в количестве 1 x 104 клеток/лунку в 48-луночный планшет. После культивирования в течение ночи клетки обрабатывали различными концентрациями (16,625 нМ, 31,25 нМ, 62,5 нМ, 125 нМ, 250 нМ) нокодазола. В этот момент в образец добавляли зеленый краситель CellTox (Promega, G8742), который связывается с ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны во время клеточной смерти. Изображения клеток получали каждые 1 час в течение 48 часов с помощью микроскопа Celloger® Mini Plus, затем изображения анализировали с помощью программы Analysis.
В результате обработки клеток нокодазолом в различных концентрациях и их визуализации с течением времени морфология клеток изменялась в зависимости от концентрации, а при визуализации в светлом поле наблюдалось уменьшение конфлюэнтности (рис. 1А, Б). Кроме того, флуоресцентная визуализация мертвых клеток, окрашенных красителем CellTox, измерение их покрытия и количественная оценка гибели клеток показали, что доля флуоресцирующих клеток увеличивается при апоптозе (рис. 1С).
Рис. 1 Анализ дозозависимой гибели клеток от нокодазола с помощью временной визуализации
Объединенные изображения флуоресценции и визуализации в светлом поле для каждой концентрации нокодазола. Изображения показаны с интервалом в 24 часа, зеленая флуоресценция указывает на мертвые клетки. (Масштабная линейка: 200 мкм)
График общей плотности клеток (%) с течением времени
График уровня гибели клеток (%) с течением времени
График конфлюэнции с течением времени можно получить, рассчитав конфлюэнцию захваченных изображений с помощью программного обеспечения Analysis. Кроме того, измеряя охват флуоресценции, можно количественно определить степень апоптоза в зависимости от концентрации нокодазола
Мониторинг цитотоксичности
Цитотоксичность клеток - это способность некоторых химических веществ или клеток-медиаторов разрушать живые клетки. При использовании цитотоксического соединения здоровые живые клетки могут либо подвергнуться некрозу (случайной гибели клеток), либо апоптозу (запрограммированной гибели клеток). Для измерения цитотоксичности мертвые клетки окрашивали красным флуоресцентным красителем.
Был проведен контроль цитотоксичности клеток Hela с помощью Celloger® Nano 4X. Время интервала составляло 1 час, 72 цикла, общее время работы - 71 час. Красная флуоресценция указывает на мертвые клетки (рис. 2).
Рис. 2. Мониторинг цитотоксичности клеток. (A) Живых клеток было еще много. (B) Почти красные пятна
Умирающие клетки имеют сильно нарушенные клеточные мембраны, поэтому в структуре клеток можно увидеть красные флуоресцентные красители. А микрокоп Celloger® Nano может отслеживать весь процесс в режиме реального времени.
