Арт. Celloger Pro
Данио-рерио, наряду с мышами, является известной животной моделью, широко используемой в биологических исследованиях, таких как эпигенетика [Balasubramanian, S., Raghunath, A., & Perumal, E. (2019)], клинические исследования [Kinth, P., Mahesh, G., & Panwar, Y. (2013)], нейронаучные исследования [Stewart, A. M., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., & Kalueff, A. V. (2014).] и так далее. В основном это связано с тем, что эмбрионами и личинками данио-рерио легко манипулировать генетически, а также их легко визуализировать с помощью оптического микроскопа, поскольку они имеют небольшой размер и высокую оптическую четкость.
Микроскоп Celloger® Mini Plus обеспечивает функцию съемки в режиме Z-стэка, которая автоматически генерирует многослойные изображения, а программное обеспечение для анализа Celloger® предлагает функцию «слияния», позволяющую легко объединять многослойные флуоресцентные изображения. Это позволяет исследователям наблюдать трехмерные (3D) структуры на одном изображении. Исследователи наблюдали за трансгенными данио-рерио (личинками), экспрессирующими зеленый флуоресцентный белок (GFP), используя эти функции, как подробно описано в пунктах Шаг 1 и Шаг 2 ниже.
Шаг 1. Получение Z-стэков
3D-структуры, такие как ткани, состоящие из клеток, предоставляют различную информацию в зависимости от точки фокусировки. Когда вы задаете расстояние между слоями («шаг») и количество снимков («N, N'»), микроскоп Celloger® генерирует многослойные изображения через равные промежутки времени («шаг») выше и ниже заданной позиции (позиция Z) (рис. 1). Для каждой точки можно вводить различные настройки, и в разных точках можно выполнять различное Z-стекирование.
Рис. 1 Z-стэк
Исследователи использовали микроскоп Celloger® Mini Plus, который позволяет получать флуоресцентные изображения, для создания Z-стека изображений флуоресцентных трансгенных данио-рерио. Поскольку приемлемая плоскость фокусировки варьируется для каждой части трехмерной личинки, исследователи проверяли подходящие фокальные плоскости, манипулируя моторизованной подвижкой по оси Z. Исследователи определили верхнюю (Z = 4,585) и нижнюю (Z = 4,685) фокальные плоскости среди нескольких фокальных плоскостей и установили координату (Z = 4,635), соответствующую середине, в качестве позиции сканирования. Кроме того, исследователи задали пять снимков с интервалом 10 мкм выше и ниже позиции сканирования в качестве центра (рис. 2). На рисунке 3 показаны снимки, сделанные в верхней, средней и нижней фокальных плоскостях данио-рерио. При виде сбоку в нижней фокальной плоскости отчетливо видна форма головы, а в верхней фокальной плоскости отчетливо видна вентральная часть.
Рисунок 2. Процедура
Рисунок 3. Результат
Шаг 2. Z-проекция
Многослойная визуализация (Z-стекинг) необходима для наблюдения за 3D-моделью. Однако интерпретация результатов нескольких изображений, полученных с помощью многослойной визуализации, требует больших усилий и времени. Функция Z-проекции, объединяющая несколько слоев в одно изображение, позволяет с первого взгляда увидеть 3D-образец как единое изображение, тем самым повышая проницательность исследователя.
Тип проекции - это метод интегрирования нескольких координат Z, расположенных в каждой позиции X-Y. «Максимальный» используется для интеграции самого яркого пикселя среди нескольких точек координат Z, а «средний» - для расчета средней яркости нескольких точек координат Z (рис. 1). Кроме того, для получения более четкого изображения в программу анализа Celloger® была добавлена функция «добавить значение отклонения» - элемент, который может быть усилен.
Рисунок 1. Объяснение типа Z-проекции
Если изображения, полученные с помощью Z-стека, открыть в программе анализа Celloger® и нажать кнопку «объединить» на вкладке Z-стека, можно получить изображение с Z-проекцией (Рисунок 2). Соответствующий тип проекции различается для разных образцов; рекомендуется подтвердить результат для каждого типа. На рисунке 3 показан результат сшивания трех изображений для проекции при выборе типа «максимальный» и опции «добавить значение отклонения». Структура головы четко выражена в нижней фокальной плоскости, а уникальная форма брюшка, которую можно наблюдать в верхней фокальной плоскости, выражена в виде одного изображения с помощью функции проецирования.
Рисунок 2. Процедура
Рисунок 3. Результат
Заключение
Исследователи успешно получили высококачественные флуоресцентные изображения данио-рерио с помощью микроскопа Celloger® Mini Plus. Многослойная информация трехмерной структуры была успешно объединена и четко выражена в одном изображении. Этот эксперимент подтверждает возможность получения 3D-изображений с использованием других типов образцов, включая сфероиды и органоиды, что может расширить спектр доступных исследователям возможностей.
