Задача исследования
Лаборатория доктора Ричарда Уилера изучает паразитов лейшмании, которые являются высоко подвижными одноклеточными эукариотами - эта подвижность жизненно важна для их жизненного цикла. Одноклеточный паразит лейшмании ответственен за распространение лейшманиоза, которым страдают миллионы людей в развивающихся странах. Давняя цель группы доктора Уилера заключается в том, чтобы иметь возможность визуализировать динамику внутриклеточных флуоресцентно меченных белков во время движения, особенно белков в жгутике. Это сложная задача из-за высокой частоты кадров (> 100 кадров в секунду), необходимой для «замораживания» жгутикового движения, в сочетании с необходимостью одновременного захвата двух флуоресцентных каналов для анализа совместной локализации.
Рис. 1. Делитель изображения OptoSplit II для формирования двух изображений
Традиционные подходы к формированию изображения с двумя длинами волн, такие как моторизованное колесо со сменными оптическими фильтрами или дополнительная камера и светоделитель, в этом эксперименте не являются идеальными решениями, поскольку скорость переключения электронного переключателя фильтров ограничивает временное разрешение, в то время как вторая камера увеличивает стоимость и сложность системы визуализации микроскопа.
Решение от Cairn Research
Делитель изображения OptoSplit II разработанный компанией Cairn Research в сочетании с подходящей камерой может обеспечить одновременную двухцветную съемку с высокой частотой кадров, проецируя флуоресценцию от одной флуоресцентно маркированной группы белков на одну половину сенсора камеры, а флуоресценцию от второй группы белков – на другую половину сенсора камеры. Это позволяет одновременно отслеживать динамику двух очень мобильных популяций молекул на одной камере, где каждая группа помечена различным флуоресцентным репортером. В своем последнем препринте bioRxiv группа доктора Уилера использовала делитель изображения OptoSplit II в сочетании с камерой Neo sCMOS (Andor Technology, Великобритания) для изучения асимметрии биения жгутика в движущейся лейшмании. В одном из экспериментов они одновременно контролировали с высокой частотой кадров маркер мембраны жгутика, меченный красителем mCherry, и маркер структуры цитоскелета на основе асимметричной микротрубочки, меченный красителем mNeonGreen.
Рис. 2. Система, показанная на этом фото, используется для двухцветной широкопольной эпифлуоресцентной микроскопии с высокой частотой кадров паразитов лейшмании. Делитель изображения OptoSplit II подключается к левому боковому порту инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer A1 и соединяется с камерой Andor Neo, содержащей широкоформатный сенсор sCMOS (диагональ 21,8 мм). Делитель изображения OptoSplit II позволяет камере обнаруживать два разных спектрально разделенных флуорофора (например, зеленый и красный флуоресцентные репортеры) одновременно. Кроме того, делитель изображения OptoSplit II также можно использовать для одноцветной микроскопии с двумя фокальными плоскостями. Здесь два изображения, спроецированные делителем изображения, имеют разные фокальные плоскости в одном и том же образце. Поэтому молекулы с флуоресцентной меткой можно отслеживать по размерам x, y и z.
Выводы
Группа доктора Ричарда Уилера заинтересована в выяснении процессов, ответственных за подвижность на основе жгутика у паразита лейшмании, и они используют комбинацию молекулярных и биохимических методов, поддерживаемых математическим и вычислительным моделированием, биофизикой и автоматическим анализом изображений для достижения этой цели. Исследователи адаптировали один из своих инвертированных микроскопов для двухцветной широкопольной эпифлуоресцентной микроскопии с высокой частотой кадров, используя делитель изображения OptoSplit II и камеру sCMOS Neo, что позволило им обнаружить и отслеживать несколько флуоресцентно меченных молекул с высоким временным разрешением. Этот подход позволил по-новому взглянуть на механизм движения жгутика лейшмании, что потенциально поможет в разработке новых антипаразитарных методов борьбы с лейшманиозом.
Комментарии доктора Ричарда Уилера, Оксфордский университет – «Делитель изображения OptoSplit II предоставил мне очень экономичное и простое в использовании решение для синхронной съемки двухцветной флуоресценции с помощью высокоскоростной камеры. Его автономное исполнение идеально подходит для исследования патогенов и позволяет легко перенастроить микроскоп для других экспериментов».