Оптическое разрешение в световой микроскопии дальнего поля ограничено дифракционным пределом 200-250 нм, что ограничивает нашу способность «видеть» структуры различных субклеточных особенностей (например, комплекс ядерных пор). Микроскопия сверхвысокого разрешения, включая микроскопию локализации одной молекулы (SMLM), например, PALM и STORM могут достигать до 10-кратного улучшения бокового разрешения, в значительной степени зависящее от используемого флуоресцентного красителя. В методах SMLM микроскопии важно ограничить число флуоресцентных молекул, которые являются «активными» (т.е. способные испускать фотоны) в любое время, чтобы каждая молекула могла различаться отдельно от других.
В «прямом» STORM (или dSTORM) методе микроскопии это достигается путем стимулирования молекул флуоресцентного красителя, заставляя их «мигать» (т.е. включаться и выключаться) - явление, которое требует определенного набора экспериментальных условий (например, состав буфера формирования изображения и т. д.). Кроме того, точность, с которой одна молекула может быть локализована относительно другой молекулы зависит (по крайней мере частично) от количества фотонов, испускаемых молекулой - чем больше регистрируется фотонов, тем выше точность локализации одной молекулы.
Одновременное получение изображений с высоким разрешением двух флуорофоров может быть достигнуто с помощью делителя изображений такого как OptoSplit II, произведенного компанией Cairn Research. В нем дихроичное зеркало разделяет излучаемый свет на две отдельные спектральные полосы благодаря использованию соответствующего полосового оптического фильтра излучения для каждого из каналов. Делитель изображения OptoSplit II предназначен для максимизации количества пропускаемых фотонов к детектору (чаще всего в качестве детектора используется sCMOS или EMCCD камера), что является ключевым требованием для этого приложения и для этой цели используются многоэлементные промежуточные линзы и «ультраплоские» зеркала с диэлектрическим покрытием изготавливаемые на заказ.
Доктор Руишенг Лин является исследователем в лаборатории профессора Кристиана Соллера в Университете Эксетера. Одним из основных направлений работы этой группы является связь между клеточной архитектурой в нанометровом масштабе и сократительной функцией сердечной мышцы. Используя широкий ряд методов флуоресцентной микроскопии, они способствуют нашему пониманию молекулярных механизмом, участвующих в биении сердечной мышцы. Члены этой лаборатории регулярно используют делитель изображений OptoSplit II для двухцветной dSTORM и DNA Paints (накопление точек ДНК для получения изображений в наноразмерном масштабе) микроскопии (Прим. 1).
Рисунок 1 - Двухцветное изображение dSTORM ткани сердца свиньи, помеченное флуорофорами Alexa Fluor 647 и Alexa Fluor 700 в водном буфере MEA. Мишенями являются SERCA2 ATPase (красный, A700) имRyR2 (зеленый, A647). Образец подготовлен и изображение сделано доктором Алексом Клоули (Университет Эксетера).
Рисунок 2 - Двухцветное изображение DNA PAINT ткани сердца свиньи, показывающее локализацию рецепторов рианодина (пурпурный) относительно поперечной трубчатой системы («t-система», синяя). По сравнению с методом микроскопии с мерцающими флуоресцентными красителями dSTORM, метод DNA-PAINT, который опирается на гибридизацию одноцепочечных флуоресцентно-меченных ДНК-олигонуклеотидов, дает преимущество в возможности использовать очень яркие флуоресцентные красители в сочетании с буферами изображения, разработанными для оптимизации их фотонного выхода, тем самым обеспечивая точность локализации <10 нм (Прим. 2, 3). Образец подготовлен и изображение сделано доктором Алексом Клоули и Анной Мелетиу (Университет Эксетера).
Улучшение разрешения при переходе с 2D на 3D визуализацию создает дополнительные проблемы, но есть много отличных методов, которые могут быть использованы для определения осевого (или «z») положения отдельной молекулы. Например, при использовании «Интерферометрической» PALM (iPALM) микроскопии достижимо осевое разрешение 10-20 нм (Прим. 4). Тем не менее, соответствующее оборудование является сложным в использовании и может оказаться затруднительным для сборки неспециалистом. В качестве альтернативы можно использовать более простые подходы, такие как астигматизм, который может изменить форму функции рассеяния точки молекулы (PSF). В данном случае функция PSF «спроектирована» таким образом, что она может кодировать трехмерную информацию, в результате чего осевое положение отдельной молекулы определяется формой проецируемого изображения на камеру. Другой подход, называемый трехмерной биплановой микроскопией (Прим. 5), включает в себя отображение двух разных фокальных плоскостей в одном и том же образце одновременно, что позволяет получить осевое положение отдельной молекулы из двух изображений. Делитель изображения, такой как OptoSplit II от компании Cairn Research, также может быть использован для этой цели.
Рисунок 3 - Схематичное изображение делителя OptoSplit
В конфигурации «биплан» излучаемый свет проходит через неполяризационный светоделитель 50:50, который эффективно разделяет свет на два оптических пути. Как показано на рисунке 3, эти лучи помечены как «проходящий» (transmitted) и «отраженный» (reflected), при этом каждый луч света приходит и создает различное изображение на сенсоре камеры, прикрепленной к делителю изображения OptoSplit. Помещая объектив в проходящий или отраженный путь света, можно убедиться, что оптический путь «видит» другую фокальную плоскость в образце. Преимущество биплан-подхода заключается в скорости, потому что Вы можете получить изображения двух разных фокальных плоскостей одновременно, не дожидаясь пока сканирующее устройство (например, пьезоэлектрическая Z подвижка) переместится в следующее положение. Так как такой подход делит излучаемый флуоресцентный сигнал на два луча света, устройство делителя изображения, а также качество оптических компонентов, используемых в нем, является ключевым фактором, чтобы гарантировать, что ни один из испущенных флуорофором фотонов не будет потрачен впустую.
Рисунок 4 - 500-нм полистирольные шарики, полученные с помощью метода DNA-PAINT. Образец, подготовлен Тобиасом Лутцем и изображение сделано доктором Руишенг Лин (Университет Эксетера)
Левая часть рисунка: Изображения шариков после 3D коррекции дрейфа, четко показывают ожидаемую структуру в виде чаши, потому что толщина освещения примерно равняется половине диаметра шарика
Правая часть рисунка: Увеличенный вид одного шарика, а также несколько различных поперечных сечений этого шарика показаны с ориентацией каждого сечения. Наилучшее представление точек данных показано для каждого шарика, где каждая точка данных представляет собой положение флуоресцентно меченной ДНК олигонуклеотида.
В дополнение к двухцветной визуализации, доктор Руишенг Лин (Университет Эксетера) также использует делитель изображения OptoSplit II от Cairn Research для биплановой 3D-микроскопии сверхвысокого разрешения. На рисунке 4 показано несколько полистирольных шариков диаметром 500 нм, изображение которых получено с использованием метода DNA-PAINT. К поверхности шариков прикреплены нити «стыковки» ДНК и дополнительные нити «формирователя» ДНК, каждая из которых связана с флуоресцентным красителем, добавляются к образцу, содержащему шарики. Нити «формирователя» временно связываются с нитями «стыковки», производя «мерцание» на изображении, которое затем может быть локализовано. В эксперименте использовалось TIRF освещение (метод флуоресценции полного внутреннего отражения), поэтому толщина света возбуждения была ограничена несколькими сотнями нанометров. Осевой диапазон, охватываемый этим экспериментом, составлял 0-300 нм, покрывая чуть более половины диаметра шариков.
Выводы
Делитель изображения OptoSplit II был специально разработан компанией Cairn Research с учетом микроскопии сверхвысокого разрешения, предлагая конечному пользователю следующее:
- Максимальная пропускная способность: оптимизированная конструкция, включая ахроматический триплет с линзами с антиотражающим покрытием и зеркала с диэлектрическим покрытием, которое максимизируют передачу испускаемых фотонов от микроскопа к камере;
- Изображения без искажений: два внутренних оптических пути делителя изображения OptoSplit симметричны и равной длины, что важно для обеспечения того, чтобы изображения двух оптических каналов могли быть точно наложены. Кроме того, ахроматические линзы с антиотражающим покрытием предназначены для минимизации оптических аберраций и, таким образом, сохраняют форму PSF функции с ограниченной дифракцией. Кроме того, подложка, на которую наносится диэлектрическое покрытие каждого внутреннего зеркала такова, что плоскостность поверхности оптимальна для требовательных приложений, таких как микроскопия сверхвысокого разрешения. Куб с оптическими фильтрами, установленный в делителе изображения OptoSplit, может также вместить ультраплоское дихроичное зеркало толщиной 3 мм от компании Chroma (с плоскостностью поверхности <0,25 волн/дюйм). Все эти конструктивные особенности служат для максимального повышения качества и однородности получаемого изображения, а также достижения максимального отношения сигнал/шум.
- Стабильность: прочная механическая конструкция и элементы управления выравниванием оптического луча обеспечивают стабильную платформу, идеально подходящую для долговременной визуализации. Это важно, потому что в методах микроскопии на основе локализации одной молекулы часто требуются регистрация многих тысяч кадров изображения.
- Удобный, гибкий дизайн конструкции: элементы управления выравниванием оптического луча просты и интуитивно понятны, облегчая процесс оптимизации перед началом эксперимента. Также возможно изменить увеличение делителя изображения OptoSplit, помогая согласовать размер пикселя камеры с размером точки функции PSF, тем самым способствуя процессу подстройки, чтобы определить положение отдельной молекулы.
- 3D-изображения: делитель изображения OptoSplit II поддерживает несколько различных подходов для определения осевого (или z) положения одной молекулы, включая бипланную визуализацию и методы PSF-инжиниринга, такие как астигматизм.
Делитель изображения OptoSplit II является частью семейства продуктов компании Cairn Research для разделения изображений, которое также включает в себя делители изображения OptoSplit III и MultiSplit, являющиеся трехполосным и четырехполосным эмиссионными делителями изображения, соответственно. Помимо микроскопии сверхвысокого разрешения, эти устройства могут использоваться для широкого спектра других приложений визуализации, включая поляризационные исследования (анизотропия), ратиометрическую кальциевую визуализацию, одновременную многофокальную визуализацию и многое другое.
Используемая литература:
1) Jungmann, R. et al. (2017), Super-resolution microscopy with DNA-PAINT, Nature Protocols 12: 1198-1228
2) Jungmann, R. et al. (2014), Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT, Nature Methods 11: 313-318
3) Jayasinghe, I. et al. (2018), True molecular scale visualisation of variable clustering properties of ryanodine receptors, Cell Reports 22: 557-567
4) Shtengel, G. et al. (2009), Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure, PNAS 106: 3125-3130
5) Juette, M. et al. (2008), Three-dimensional sub-100nm resolution fluorescence microscopy of thick samples, Nature Methods 6: 527-529