Отслеживание кровотока глубоко в живой ткани
Акустооптическая (АО) многофотонная микроскопия — превосходный метод отслеживания кровотока на клеточном уровне с высоким пространственно-временным разрешением глубоко в живой трехмерной ткани. Уникальные режимы сканирования FEMTO3D Atlas позволяют непрерывно записывать сложные трехмерные паттерны, а его дополнительные модули позволяют одновременно отслеживать несколько параметров, таких как кровоток и клеточная активность. Эти приложения могут быть полезны в различных областях, например, в неврологии, иммунологии, дерматологии, онкологии и других.
FEMTO3D Atlas Dichro с двумя лазерными источниками для двойного возбуждения
Это расширение платформы FEMTO3D Atlas обеспечивает быстрое трехмерное сканирование области интереса (ROI) в большом трехмерном объеме, а также квазиодновременное обнаружение активности нейронов и кровотока с использованием двух разных лазерных источников. ПО Femtonics предоставляет встроенные возможности анализа ROI и кривых, отвечающие всем требованиям.
Микроскоп:
- Две пары акустооптических кристаллов для быстрой фокусировки по осям XY и Z (3D-изображение)
- Модули 4D для работы с лазерным лучом для стабилизации
- Два двухфотонных лазерных источника с разными длинами волн
- Система Dichro для быстрого переключения между двумя линиями лазеров для квазиодновременного двойного возбуждения
Процедура сбора и анализа данных
Красный декстран введен внутривенно, чтобы кровеносные сосуды окрасились в красный цвет. Проходящие эритроциты (эритроциты) отображаются в виде теней в красном потоке (рис. 1.А). Таким образом, скорость кровотока может быть измерена путем отслеживания эритроцитов в зависимости от времени (рис. 1.B).
Рис. 1. Как измерить скорость кровотока с помощью трехмерной двухфотонной визуализации. A. Пример изображения и визуализации кровотока с одной 3D-ленты на глубине ~ 200 мкм. B. Монтажное изображение, показывающее поток отдельных эритроцитов (желтые кружки и стрелки). Среднюю скорость в определенном участке капилляров или сосудов можно рассчитать по значениям скорости эритроцитов (v1, v2…vn).
Быстрая визуализация ROI с помощью современной платформы FEMTO3D Atlas на базе акусто-оптической системы позволяет выполнять трехмерное сканирование полос, отслеживая сосуды через несколько слоев коры в большом объеме мозга. Общая длина полос может достигать ~5 мм при сохранении разрешения и скорости, достаточных для измерения скорости кровотока (рис. 2).
Рис. 2. Поддерживая надлежащую скорость сканирования для трехмерного измерения кровотока, микроскоп FEMTO3D Atlas может сканировать сеть полос длиной до 5 мм. A. Трехмерная реконструкция паттерна, предназначенного для измерения кровотока в коре головного мозга мыши. B. Визуализация кровотока в виде трехмерной сети полос длиной 4.78 мм; скорость сканирования: 7 Гц.
Одновременное измерение активности нейронов и скорости кровотока
Исследование сердечных заболеваний может быть подкреплено комбинированным методом одновременной визуализации активности Са2+ и кровотока. Это дает новую возможность получения локальной информации о состоянии нейронов и сердечно-сосудистой системы. Используя FEMTO3D Atlas Dichro с двумя лазерными источниками с разной длиной волны, можно одновременно измерять движение клеток крови и активность нейронов. Быстрое переключение между двумя лазерными источниками позволяет квазиодновременно получать изображения на двух разных длинах волн излучения. Этот метод может быть полезен для изучения неблагоприятных последствий инсульта для состояния сосудов, повреждения нейронов и даже процессов регенерации (рис. 3).
Рис. 3. Одновременная визуализация активности нейронов и кровотока. Нейрон зрительной коры отображается зеленым цветом; красный указывает на сосуды (в виде вертикальной полосы).
Рис. 4. Визуализация кровотока в глазах рыбок данио in vivo. Красный: клетки крови, меченные tdTomato. Зеленый: нейроны, меченные GCaMP6.
