Арт. Celloger Pro
Введение
Системы клеточных культур незаменимы в области биомедицинских исследований, где 2D-культуры широко используются из-за их экономичности и удобства. Тем не менее, ограничения 2D-культур, такие как потеря взаимодействия между клетками или клетками и матриксом, а также тканеспецифических структур, препятствуют имитации in vivo условий, особенно в моделях таких заболеваний, как рак [Fang, Ye, and Richard M. Eglen. 2017]. В связи с этими ограничениями растет интерес к 3D-культурам, которые обеспечивают более реалистичную модель, напоминающую сложную среду in vivo. Эти 3D-системы обладают огромными возможностями для мониторинга таких важных факторов, как цитотоксичность, лекарственная устойчивость и клеточные реакции в микросреде рака [Ravi, Maddaly, et al. 2015; Baek, NamHuk, et al. 2016]. Кроме того, они значительно повысили безопасность и эффективность лекарств, способствуя открытию и разработке лекарств на ранних стадиях [Huang, Zhaoming, Panpan Yu, and Jianhui Tang. 2020].
Представленное здесь исследование демонстрирует возможности микроскопа Celloger® Pro от Curiosis, передовой системы визуализации живых клеток, в изучении влияния противоракового препарата стауроспорина на 3D-сфероиды, созданные из стабильных клеток HEK293-GFP. В этой статье подробно описаны результаты, полученные с помощью микроскопа Celloger® Pro, демонстрирующие его способность динамически фиксировать и количественно оценивать клеточные реакции на лекарственную терапию в трехмерном контексте.
Метод исследования
Клетки HEK293-GFP высевали в количестве 10 000 клеток/лунку в 96-луночный планшет (SPL, 34896), способствующий формированию сфероидной структуры. После ночной инкубации проводили обработку различными концентрациями стауроспорина (SSP): 0 мкМ (контроль), 0,1 мкМ и 1 мкМ. Дополнительно обрабатывали 4 мкМ EthD-1 (Sigma, 46043) флуоресцентным маркером, избирательно окрашивая мертвые клетки. Затем проводили визуализацию в реальном времени с помощью микроскопа Celloger® Pro. Изображения получали с интервалом в 30 минут в течение 24 часов с объективом 2X.
Результаты
Чтобы изучить реакцию сфероидов HEK293-GFP на противораковый препарат SSP, исследователи наблюдали за уменьшением размера сфероидов в реальном времени с помощью микроскопии светлого поля и визуализации зеленой флуоресценции. Одновременно в разных временных точках оценивали гибель клеток, измеряя интенсивность красной флуоресценции. При увеличении концентрации SSP наблюдался соответствующий рост интенсивности красной флуоресценции, что свидетельствовало о гибели клеток. С течением времени эта тенденция становилась все более выраженной (рис. 1А). Относительная интенсивность красной флуоресценции была оценена количественно и представлена в графическом виде с помощью программы анализа Celloger® Pro, что позволило наглядно проиллюстрировать реакцию сфероидов на гибель клеток, вызванную лекарственными препаратами (рис. 1D).
Кроме того, прогрессирующая гибель клеток сопровождалась уменьшением размера сфероида, о чем свидетельствовали изображения зеленого канала флуоресценции. Это наглядно продемонстрировало корреляцию между уменьшением размера сфероида и усилением красной флуоресценции на объединенных изображениях зеленой и красной флуоресценции, обеспечив прямую визуализацию влияния препарата на жизнеспособность клеток (рис. 1А). Чтобы дополнительно подтвердить уменьшение размера сфероида, вызванное обработкой SSP, исследователи точно измерили диаметр сфероида с помощью программы анализа Celloger® Pro (рис. 1В). Размер сфероида был определен количественно и эффективно визуализирован с помощью графического представления, что позволило получить четкое и полное представление о наблюдаемых изменениях (рис. 1С). Этот результат подчеркивает способность микроскопа Celloger® Pro в режиме реального времени давать представление о динамических изменениях, происходящих в трехмерных клеточных структурах.
Рисунок 1. Результаты исследования сфероидных клеток с 0, 0.1 и 1 мкМ SSP.
(A) Объединенные изображения зеленой и красной флуоресценции для каждой концентрации SSP (масштабная линейка: 200 мкм). (B) Изображения в светлом поле с диаметром сфероида (масштабная линейка: 200 мкм). (C) Сравнительный график площади сфероидов в 0 и 24 часа для каждой концентрации SSP. n=3 для каждой группы. ***P < 0,0001 (D) График относительной интенсивности красной флуоресценции с течением времени.
Заключение
Результаты, представленные в этой статье, демонстрируют неоценимые возможности микроскопа Celloger® Pro в исследовании сложных клеточных явлений. Динамически отслеживая уменьшение размеров 3D-сфероидов при обработке SSP и количественно оценивая изменения интенсивности флуоресценции в ответ на маркеры клеточной смерти, Celloger® Pro оказывается незаменимым инструментом как для качественного, так и для количественного визуализации живых клеток. Объединив возможности 3D-культуры сфероидов с возможностями визуализации в реальном времени Celloger® Pro, исследователи наконец-то продемонстрировали его потенциал для революционной оценки реакции на лекарственные препараты и способствовали продвижению открытия лекарств на ранних стадиях. Исследователи смогут использовать его возможности для раскрытия тонкостей клеточной реакции на лекарственные препараты в трехмерном контексте, что приведет к более глубокому пониманию и ускорению прогресса в противораковых исследованиях и не только.
