Возбуждение 3P осуществляется в диапазоне длин волн возбуждения 1200–1700 нм, обеспечиваемом лазерной системой с усилением. Более длинные волны возбуждения меньше рассеиваются в биологических тканях, что увеличивает глубину проникновения, уменьшает внефокусное возбуждение и увеличивает отношение сигнал/шум. Оптическая конструкция, необходимая для возбуждения 3P, обеспечивает более высокое осевое разрешение, чем у двухфотонной микроскопии. Спектральное окно обеспечивает трехфотонное возбуждение различных флуорофоров, таких как нынешние поколения генетически кодируемых индикаторов кальция на основе белков (например, GCaMP6), а частота повторения лазерного источника достаточна для визуализации переходных процессов Ca2+, вызванных нейронной активностью.
Флуоресцентная активность, измеренная на нескольких соматах из области V1 мыши, меченной GCaMP
Особенности:
- Диапазон длин волн возбуждения: 1200-1700 нм
- Функциональная и структурная визуализация на всю глубину коры; выгодно в сильно рассеивающих образцах
- Разрешение XY ограничено дифракцией (менее 1 мкм, зависит от длины волны) Разрешение по Z ~ 5-10 мкм (в зависимости от образца и длины волны)
- Возбуждает флуорофоры методом трехфотонного возбуждения: 3P диапазон длин волн (1200-1700 нм) соответствует обычному (1P) диапазон длин волн возбуждения флуорофоров от синиего к красному
- Меньшее повреждение тканей по сравнению с возбуждением 2P
Спонтанная активность нейронов в зрительной коре головного мозга мыши, меченной GCaMP6f. Клетки возбуждали с использованием лазера с длиной волны 1300/1400 нм
Преимущества:
- Функциональная и структурная визуализация на всю глубину коры
- Дает преимущество в сильно рассеивающем образце
- Доступна опция генерации третьей гармоники
Апгрейд микроскопа до 3P состоит из:
- Лазер накачки и неколлинеарный оптический параметрический усилитель (NOPA);
- Высококачественные оптические элементы для оптимальной передачи в диапазоне 1200-1700 нм (с дополнительным расширением)
- Оптомеханика для оптической системы.
Анатомическая визуализация 3P: изображение коры головного мозга мыши с глубины 1000 мкм. Фиолетовый: кровеносные сосуды, зеленый: перициты, меченные GFP
Генерация третьей гармоники
Генерация третьей гармоники — это специфический эффект 3P-возбуждения, возникающий в результате преобразования трех входящих фотонов в один испускаемый фотон с утроенной энергией и, таким образом, испускание света, равного одной трети длины волны. ГТГ возникает на структурных поверхностях, которые образуются между водными жидкостями и богатыми липидами структурами, например, биологическими мембранами, а также между водой и крупными белковыми агрегатами, такими как пучки коллагена или мышечные волокна.
Изображение среза почки мыши, полученное при генерации 3 гармоники: клетки почки возбуждались на длине волны 1500 нм, а испускаемые фотоны собирается в зеленом канале (~500 нм) детектора система.